2)。
[0093] 2.2苹果胚原生质体的制备
[0094] 用CPW13M浸泡步骤2.1得到的悬浮细胞lh，弃上层液体，得到CPW13M处理的悬浮细 胞;按照CPW13M处理的悬浮细胞和酶液的体积比为1:10的比例向CPW13M处理的悬浮细胞中 加入酶液，得到酶-悬浮细胞混合液，将酶-悬浮细胞混合液在弱光(500lux)、23± 1°C、40r/ min下孵育20h，得到酶解后的酶-悬浮细胞混合液（图3);将酶解后的酶-悬浮细胞混合液用 300目尼龙网筛轻轻研磨过滤，释放原生质体，得到酶-原生质体混合液；
[0095] 按照下述方法纯化酶-原生质体混合液中的原生质体:将酶-原生质体混合液轻轻 加至CPW25S上，过程轻柔缓慢，避免冲撞分界面，尽量使其保持稳定，得到下层为CPW25S上 层为酶 -原生质体混合液的分层液体1;将分层液体1在800rpm下离心15min，使原生质体位 于所述分层液体1的界面处（图4中A)，小心地将界面处的原生质体层吸出，得到苹果胚原生 质体;将苹果胚原生质体置于新的离心管中，用W5溶液洗涤2-3次，每次洗涤均在800rpm下 离心6min，最后用W5溶液重悬苹果胚原生质体，得到苹果胚原生质体悬浮液。
[0096] 将苹果胚原生质体进行镜检，结果如图4中B和C所示，结果显示，纯化后可得到高 质量的由细胞膜包裹着的圆球状苹果胚原生质体。
[0097]二、苹果中目的基因的瞬时表达 [0098] 1、目的基因的准备
[0099] 将载体E3025的EcoR I和Sal I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.l所示的 MsDREB2C基因（MsDREB2C基因为苹果基因），得到重组载体E3025-MsDREB2C，E3025-MsDREB2C表达SEQIDNo.2所示的蛋白质。
[0100] 其中，SEQ ID No.l为MsDREB2C基因的序列，编码SEQ ID如.2所示的]\^01^82(：蛋 白。MsDREB2C基因在细胞核中表达。
[0101] 2、苹果中目的基因的瞬时表达
[0102] 按照下述方法完成目的基因转化苹果胚原生质体，并将载体E3025作为对照：
[0103] 1)将步骤一的2.2的苹果胚原生质体悬浮液于冰上放置30min后，于800rpm下离心 6min，弃上清液，得到苹果胚原生质体；向苹果胚原生质体中加入500yL MMg重悬原生质体， 得到苹果胚原生质体MMg悬浮液；
[0104] 2)向步骤1)的100μL苹果胚原生质体ΜMg悬浮液中加入10μg步骤1的重组载体 E3025-MsDREB2C-GFP，轻轻混匀，得到苹果胚原生质体-E3025-MsDREB2C-GFP混合液；向苹 果胚原生质体-E3025-MsDREB2C-GFP混合液中加入110yL PEG6000水溶液，混匀后得到待转 化液;将待转化液于23°C下孵育lOmin进行原生质体的转化，得到原生质体的转化液；
[0105] 3)向步骤2)的原生质体的转化液中加入440yL CPW13M，轻轻颠倒，得到转化后液 体;将转化后液体于800rpm下离心6min，弃上清液，得到转化后的原生质体；
[0106] 4)向步骤3)的转化后的原生质体中加入10OyL CPW13M溶液轻柔混匀后，再加入 900yL CPW13M，然后于细胞培养板上、23±1°C、弱光(5001ux)下孵育18h，得到转化lOmin的 苹果胚原生质体。
[0107] 按照步骤1)-4)的方法，将孵育lOmin分别替换为孵育15min、孵育20min和孵育 30min，其他步骤均不变，分别得到转化15min的苹果胚原生质体、转化20min的苹果胚原生 质体和转化30min的苹果胚原生质体。
[0108] 激光共聚焦显微镜下观察转化lOmin的苹果胚原生质体、转化15min的苹果胚原生 质体、转化20min的苹果胚原生质体和转化30min的苹果胚原生质体中目的基因的瞬时表达 情况基本无差异，其中转化20min的苹果胚原生质体中目的基因的瞬时表达情况如图5所 不。
[0109] 结果显示，对照中绿色荧光信号分布在整个原生质体细胞中，而转化lOmin的苹果 胚原生质体、转化15min的苹果胚原生质体、转化20min的苹果胚原生质体和转化30min的苹 果胚原生质体中绿色荧光信号均集中在细胞核区域，表明MsDREB2C基因在细胞核区域有表 达，与MsDREB2C基因在自然情况下的表达特点一致。上述结果表明，本发明的方法可以将目 的基因在苹果中进行瞬时表达，并可进行目的基因的功能验证。
【主权项】
1. 苹果转化方法，包括以苹果胚原生质体为受体进行苹果转化； 所述苹果胚原生质体的制备方法包括下述A1)和A2): A1)将苹果胚性愈伤组织进行悬浮继代培养，得到悬浮细胞； A2)用纤维素酶和果胶酶酶解所述悬浮细胞得到所述苹果胚原生质体。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述用纤维素酶和果胶酶酶解所述悬浮细 胞前还包括将所述悬浮细胞用CPW13M进行处理;所述CPW13M为向细胞-原生质体清洗液中 加入甘露醇得到的甘露醇的质量百分比浓度为11 % -15 %的溶液。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：用所述CPW13M处理所述悬浮细胞的时间为 0.5~2h〇4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述A2)包括A21)和A22): A21)用含有所述纤维素酶和所述果胶酶酶的酶液浸泡所述悬浮细胞，得到酶-原生质 体混合液； A22)将所述酶-原生质体混合液加至CPW25S上，得到下层为CPW25S上层为酶-原生质体 混合液的分层液体1;将所述分层液体1进行离心，使原生质体位于所述分层液体1的界面 处，分离原生质体，得到所述苹果胚原生质体； 所述CPW25S为向所述CPW溶液中加入蔗糖得到的溶液;所述CPW25S中蔗糖质量百分比 浓度为23 %-27 %。5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述苹果胚性愈伤组织的制备方 法包括:将苹果胚在诱导培养基上进行诱导培养得到苹果胚性愈伤组织； 所述诱导培养基为向MS培养基中加入BA、2，4-D和蔗糖得到的固体培养基。6. 根据权利要求4或5所述方法，其特征在于:所述苹果胚性愈伤组织的制备方法还包 括将所述苹果胚性愈伤组织在继代培养基上进行继代培养； 所述继代培养基为向MS培养基中加入BA、2，4-D和蔗糖得到的固体培养基。7. 根据权利要求1-6中任一所述方法，其特征在于：所述苹果为用于苹果砧木的苹果 种。8. 下述P1或P2的方法： P1、权利要求1-7中任一所述苹果胚原生质体的制备方法； P2、权利要求5-7中任一所述苹果胚性愈伤组织的制备方法。9. 下述Ml或M2的产品： M1、用于制备苹果胚原生质体的成套试剂，为权利要求1-6中所述悬浮系继代培养基、 所述CPW13M、所述CPW25S、所述细胞-原生质体清洗液、所述纤维素酶、所述果胶酶酶、所述 诱导培养基、所述继代培养基中的至少两种； M2、用于诱导苹果胚性愈伤组织的成套试剂，为权利要求5所述诱导培养基和/或权利 要求6所述继代培养基。10. 下述任一应用： XI、权利要求1-7中任一所述苹果转化方法在苹果中瞬时表达目的基因中的应用； X2、权利要求1-7中任一所述苹果胚原生质体的制备方法在苹果中瞬时表达目的基因 中的应用； X3、权利要求5-7中任一所述苹果胚性愈伤组织的制备方法在苹果中瞬时表达目的基 因中的应用； X4、权利要求9所述产品在苹果中瞬时表达目的基因中的应用； X5、权利要求1-7中任一所述苹果转化方法在植物基因功能验证中的应用； X6、权利要求1-7中任一所述苹果胚原生质体的制备方法在植物基因功能验证中的应 用； X7、权利要求5-7中任一所述苹果胚性愈伤组织的制备方法在植物基因功能验证中的 应用； X8、权利要求9所述产品在植物基因功能验证中的应用； X9、权利要求5-7中任一所述苹果胚性愈伤组织的制备方法在制备苹果胚原生质体的 中的应用； X10、权利要求5-7中任一所述苹果胚性愈伤组织的制备方法在苹果转化中的应用； XII、权利要求1-7中任一所述苹果胚原生质体的制备方法在制备苹果胚原生质体的中 的应用。
【专利摘要】本发明公开了目的基因转化苹果的方法及其在苹果中瞬时表达目的基因中的应用。本发明所提供的苹果转化方法，包括用含有目的基因的侵染液侵染苹果胚原生质体，完成苹果转化；苹果胚原生质体的制备方法包括：A1)将苹果胚性愈伤组织在悬浮系继代培养基中进行悬浮继代培养，得到悬浮细胞；A2)用CPW13M处理悬浮细胞，得到CPW13M处理的悬浮细胞；A3)用纤维素酶和果胶酶酶解CPW13M处理的悬浮细胞得到所述苹果胚原生质体。实验证明，本发明的苹果转化方法可以将目的基因在苹果中进行瞬时表达，可以用来进行目的基因的功能验证及蛋白质和细胞器的定位，还可用来检测蛋白质互作及细胞代谢。
【IPC分类】C12N15/82, C12N5/04
【公开号】CN105647963
【申请号】
【发明人】李天红, 刘冬, 郭萧, 赵迪, 王彦涛
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月14日