伤组织的制备方法在苹果转化中的应用；
[0055] XII、所述苹果胚原生质体的制备方法在制备苹果胚原生质体的中的应用。
[0056] 本发明中，所述苹果可为可用于苹果砧木的苹果种，如新疆野苹果（Malus sieversii Roem)〇
[0057]本发明中，所述悬浮系继代培养基可为无菌培养基。所述诱导培养基可为无菌培 养基。所述继代培养基可为无菌培养基。所述CPW13M可为无菌液体。所述酶液可为无菌液 体。所述CPW25S可为无菌液体。
[0058]实验证明，本发明的苹果转化方法能将目的基因在野生苹果中进行瞬时表达，并 使目的基因得到表达:对照中绿色荧光信号分布在整个原生质体细胞中，而转化目的基因 MsDREB2C基因的苹果胚原生质体中绿色荧光信号集中在细胞核区域，表明MsDREB2C基因在 细胞核区域有表达，与MsDREB2C基因在自然情况下的表达特点一致。本发明的苹果胚性愈 伤组织的制备方法能制备苹果胚性愈伤组织:利用本发明的苹果胚性愈伤组织的制备方法 得到的愈伤组织颜色淡黄、质地松脆、表面有颗粒状凸起，镜检观察到细胞为圆形细胞，并 且经多次继代培养后形态稳定，增殖能力强。本发明的苹果胚原生质体的制备方法能制备 高质量的由细胞膜包裹着的圆球状苹果胚原生质体。
[0059]实验证明，本发明的苹果转化方法可以将目的基因在苹果中进行瞬时表达，可以 用来进行目的基因的功能验证及蛋白质和细胞器的定位，还可用来检测蛋白质互作及细胞 代谢。
【附图说明】
[0060]图1为苹果胚性愈伤组织的外观。其中，A为苹果幼胚接种后ld;B为苹果幼胚接种 后7d;C为苹果幼胚接种后21d;D为继代培养一次的苹果胚性愈伤组织;E为继代培养三次的 苹果胚性愈伤组织;F为继代培养五次的苹果胚性愈伤组织。
[0061 ]图2为悬浮细胞。
[0062] 图3为苹果胚性愈伤组织的酶解结果。其中A为酶解前，B为酶解后。
[0063] 图4为苹果胚原生质体的纯化和镜检。其中A为纯化过程中的分层情况，1为酶解 液，2为原生质体层，3为残渣及CPW25S;B为未经纯化的原生质体镜检结果;C为纯化后的原 生质体镜检结果。
[0064]图5为目的基因在苹果胚原生质体中的表达情况。其中，A为明场下的转化E3025-MsDREB2C的苹果胚原生质体;B为暗场下的转化E3025-MsDREB2C的苹果胚原生质体;C为明 暗叠加场下的转化E3025-MsDREB2C的苹果胚原生质体;D为明场下的转化E3025的苹果胚原 生质体;E暗场下的转化E3025的苹果胚原生质体;F为明暗叠加场下的转化E3025的苹果胚 原生质体。Bar = 10ym〇
【具体实施方式】
[0065]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0066] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0067] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0068]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为在室温（23 ± 1°C )下进行。下述实 施例中的新疆野苹果(Malus sieversii Roem)(李育农.2001.苹果属植物种质资源研究. 北京：中国农业出版社:20-134.)，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的 相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0069] 下述实施例中的载体E3025为将pSAT6-RFP-Nl载体中的RFP基因替换为GFP基因， 保持其他序列不变得到的载体，载体E3025表达绿色荧光蛋白GFP。其中pSAT6-RFP-Nl载体 记载在文南犬（Sang-Min Chung et al.A versati le vector system for multiple gene expression in plants .TRENDS in Plant Science Vol.lONo.8August 2005)中。公众可 从申请人处获得载体E3025,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用 途使用。
[0070] 下述实施例中的诱导培养基为向MS培养基中加入BA、2,4_D和蔗糖得到的无菌固 体培养基;其中84、2,4-0和蔗糖的浓度分别为31^/1、111^/1和3%(质量百分比浓度）。
[0071] 下述实施例中的继代培养基为向MS培养基中加入BA、2，4-D和蔗糖得到的无菌固 体培养基;其中BA、2，4-D和蔗糖的浓度分别为4mg/L、2mg/L和3 % (质量百分比浓度）。
[0072]下述实施例中的悬浮系继代培养基为向MS培养基中加入BA、2,4_D、维生素 C和蔗 糖得到的无菌培养基，其中BA、2，4-D、维生素 C和蔗糖的浓度分别为0.5mg/L、3mg/L、2mg/L 和3% (质量百分比浓度），pH为5.8。
[0073]下述实施例中的CPW13M为向CPW溶液中加入甘露醇得到的甘露醇质量百分比浓度 为1 3 %的无菌溶液。CPW溶液由水和溶质组成，CPW溶液的溶质及其浓度分别为 KH2P〇427.2mg/L、KN〇3 101.0mg/L、CaCl2.2H20 1480.0mg/L、MgS〇4.7H20 246.0mg/L、KI 0.16mg/L及CuS〇4 · 5H20 0.025mg/L。
[0074]下述实施例中的酶液为由溶质和溶液；溶剂为CPW13M，溶质及其浓度分别为 100000U/L Cellulase R-10、15000U/L Pectolase Y-23、0.65mol/L D-mannitol、1.0% (质量百分比浓度)聚乙烯啦咯烷酮(PVP)、0.1% (质量百分比浓度)MES和0.1% (质量百分 比浓度）85六，？!1为5.6。(^11111&%1?-10为北京优尼康生物科技有限公司产品，货号为 C8260-100;Pectolase Y-23为北京美莱博医学科技有限公司产品，货号为MMF-1069。
[0075]下述实施例中的W5溶液为由水和溶质组成的无菌溶液，W5溶液的溶质及其浓度分 别为CaCl2 · 2H2O 125mmol/L，NaCl 154·Ommol/L，KC1 5.0mmol/L，葡萄糖5.0mmol/L，一水 吗啉乙磺酸(MES)5 · 0mmol/L〇
[0076] 下述实施例中的CPW25S为向CPW溶液中加入蔗糖得到的蔗糖质量百分比浓度为 25%的无菌溶液。
[0077] 下述实施例中的MMg为由溶质和溶剂组成的无菌溶液;溶剂为水，溶质及其浓度分 别为MgCl2 15mmol/L，MES 0.1%(质量百分比浓度)和甘露醇(mannitol)0.4mol/L。
[0078] 下述实施例中的PEG6000水溶液为由溶质和溶剂组成的无菌溶液;溶剂为水，溶质 及其浓度分别为PEG6000 40% (质量百分比浓度）。
[0079] 实施例1、苹果中目的基因的瞬时表达
[0080] 苹果中目的基因的瞬时表达，包括利用苹果转化方法将目的基因转至苹果中，具 体为用含有目的基因的侵染液侵染苹果胚原生质体，完成苹果转化。实验重复三次，每次重 复实验的具体操作步骤如下：
[0081] -、苹果胚原生质体的制备
[0082] 1、苹果胚性愈伤组织的制备
[0083] 1.1外植体消毒
[0084] 将70DAFB(盛花后天数，Day after full bloom)新疆野苹果（Malus sieversii Roem)的幼果清洗干净，并用75% (体积百分比浓度）的乙醇水溶液表面消毒3min，然后用有 效氯质量百分比为5%的次氯酸钠水溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗2-3次，得到无菌幼 果。
[0085] 1.2苹果胚性愈伤组织的诱导
[0086]取出步骤1.1的无菌幼果的种子，在无菌条件下用镊子小心去除种皮，得到苹果幼 胚，将苹果幼胚切成2mm见方小块后接种于诱导培养基上，而后在23 ± TC下避光培养2Id， 得到苹果胚性愈伤组织。
[0087] 1.3苹果胚性愈伤组织的继代培养
[0088]将步骤1.2的苹果胚性愈伤组织接种于继代培养基上，而后在23 ±1°C下避光培养 18d，得到继代培养的苹果胚性愈伤组织，将该继代培养的苹果胚性愈伤组织在23±1°C、黑 暗下重复继代培养5次。
[0089] 观察步骤1.2得到的苹果胚性愈伤组织和步骤1.3的继代培养的苹果胚性愈伤组 织，苹果幼胚接种后7-21d得到的苹果胚性愈伤组织颜色淡黄、质地松脆、表面有颗粒状凸 起（图1中B和C)，镜检观察到细胞为圆形细胞，并且经多次继代培养后形态稳定，增殖能力 强(图1中D-F)〇
[0090] 2、苹果胚原生质体的制备
[0091] 2.1悬浮细胞的制备
[0092]用40目不锈钢网筛研磨步骤1得到的苹果胚性愈伤组织，得到研磨物，该研磨物 (颗粒直径约40μηι);将研磨物在悬浮系继代培养基中悬浮继代培养8d，悬浮继代培养的条 件为黑暗、150r/min下，温度为23± 1°C，重复继代培养2次，得到悬浮细胞(图