养48h后更换为诱导液 Π ，所述诱导液Π 为包含5μg/ml胰岛素的DMEM培养基培养;培养48h后更换为含有50μg/ml (重组lunasin组-50)或100μg/ml (重组lunasin组-100)重组Lunasin多肽的DMEM培养基，并 以5μg/ml罗格列酮作为阳性对照组，不加 lunasin作为空白对照组，继续培养48h后，10%甲 醛缓冲液固定4h，油红染色lh，400倍显微镜下观察脂滴堆积状况，并使用lmL异丙醇提取， 在492nm下测定吸光度。
[0072 ]本发明首次提出使用毕赤酵母表达系统制备1 unas i η多肽，通过基因工程的方法 使luansin多肽的规模化生产可以得以实现。毕赤酵母表达lunasin多肽成本低，产量高，分 立纯化步骤简单。
[0073]虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人 员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范 围由权利要求书及其等同形式所限定。
【主权项】
1. 一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征在于，所述方 法包括以下步骤： 1) 重组表达质粒的构建 设计带有EcoR I和Not I酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物，进行PCR扩增 获得目的基因片段，将目的基因片段用限制性内切酶EcoR I酶和Not I酶进行双酶切，然后 将用相同限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的质粒pPIC9K与酶切后的PCR扩增产物用 T4DNA连接酶连接，通过热激转化到大肠杆菌DH5a中培养扩增，提取得到重组表达质粒 pPIC9K_lunasin; 2) 筛选高抗性重组基因工程菌株 将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经Sac I线性化酶切，将经酶切线性化的重组表达质 粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子分别接 种于丽培养基和MD培养基，经过PCR鉴定及G418高抗性筛选，阳性克隆为重组工程菌GS115/ pPIC9K_lunasin; 3) 重组luansin多肽的发酵生产 将上述获得的G418高抗性的阳性克隆重组工程菌株GS115/pPIC9K-lunasin接种于 BMGY培养基中，在30°C下培养直至0D6QQ为2.0-4.0，离心收集细胞，然后将细胞重悬于BMMY 培养基中培养直至0D6QQ为1.0_2.0,0.5%甲醇诱导表达;经甲醇诱导重组lunasin多肽的发 酵液高速离心除去细胞后，上清液使用Trish-Tricine SDS-PAGE蛋白电泳，以筛选得到高 表达lunasin多肽的基因工程菌株； 4) 重组luans in多肽的分离纯化 将上述筛选得到的高表达重组工程菌株再次发酵生产，得到的发酵液经高速离心除去 菌体后，上清中加入CaCl2溶液，充分混匀后室温静置5min，高速离心得到沉淀，该沉淀经真 空冷冻干燥得重组lunasin多肽粗产物； 将粗产物以浓度为10mg/mL溶解，使用DEAE阴离子交换柱，根据出峰时间分部分收集洗 脱液，真空干燥后，经Trish-Tricine SDS-PAGE蛋白电泳，收集lunasin多肽富集洗脱液，合 并后过超滤膜浓缩液。浓缩液经真空冷冻干燥后得到纯度为93%的重组lunasin多肽。2. 根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其 特征在于，步骤1)中设计带有EcoR I和Not I酶切位点Lunasin序列为： GAA TTC TCC AAA TGG CAG CAC CAG CAA GAC AGC TGC CGC AAG CAG CTC CAG GGG GTG AAC CTC ACG CCT TGC GAG AAG CAC ATC ATG GAG AAG ATC CAA GGC CGC GGC GAT GAC GAT GAT GAT GAT GAC GAC GAC GCG GCC CTACTACTACTG CTG CTG CGC CGG。3. 根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其 特征在于，步骤1)中特异性扩增引物为： 上游引物：5'-GGAATT CTC CAAATG GCA GCAC-3'， 下游引物：5'-TT GGC CGC GTC GTC GTC ATCATC-3'。4. 根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其 特征在于，步骤2)中感受态毕赤酵母GS115制备方法包括以下步骤： 从YPD平板上挑取一个新鲜的毕赤酵母GS115单克隆至10ml YPD液体培养基，30°C， 250rpm培养过夜;测定过夜培养物的0D6(x)值为3.0-5.0之间；将10ml YH)过夜培养物稀释至 0D600值为Ο . 2-0.4;在28-30 °C摇床中继续培养8-12h，使其OD6〇()值达到1.0-1.5 ;于室温 1500g离心5min收集酵母细胞，弃上清；用10ml洗液洗酵母细胞，随后于室温1500g离心5min 离心收集细胞，弃上清;用lml山梨醇溶液重悬酵母细胞，以每管50μ1分装。5. 根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其 特征在于，步骤3)中： BMGY培养基配方为：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，1.34 % YNB，4 X 10_5 %生物素，1.0 %甘 油，10·0% (v/v)pH6·0磷酸缓冲液； BMMY培养基配方为：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，1.34 % YNB，4 X 10_5 %生物素，0.5 %甲 醇，10·0% (v/v)pH6·0磷酸缓冲液。6. 根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其 特征在于，步骤3)中诱导表达时间为60h，每隔24h补充甲醇至终浓度为0.5%。7. 根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其 特征在于，步骤3)中Trish-Tricine SDS-PAGE蛋白电泳条件为：40V 40min，85V 240min，电 泳环境保持在4°C。8. 根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其 特征在于，步骤4)中上样量为5mL，平衡液为含有EDTA的pH 6.8PBS，流速4mL/min，洗脱液为 1M NaCl浓度梯度30%-50%，每811^收集一管。9. 根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴 定方法，其特征在于，步骤4)中收集洗脱液过lOKDa超滤膜，收集滤出液，再过lKDa超滤膜， 收集浓缩液。10. -种根据上述任一权利要求所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达及 纯化方法获得的纯化的重组lunasin多肽的活性鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下 步骤： 将3T3-L1前体脂肪细胞以10000个细胞/mL密度接种于12孔板，生长融合后，再培养 48h，加诱导液I，所述诱导液I包含10 %FBS，1 %双抗，1 Oμg/ml胰岛素，0.5m MIBMX和0. ΙμΜ DEX的DMEM培养基培养；培养48h后更换为诱导液Π ，所述诱导液Π 包含5μg/ml胰岛素的 DMEM培养基培养;培养48h后更换为含有50μg/ml重组Lunasin多肽的DMEM培养基，并以5yg/ ml罗格列酮作为阳性对照组，不加 lunasin作为空白对照组，继续培养48h后，10%甲醛缓冲 液固定4h，油红染色lh，显微镜下观察脂滴堆积状况，并使用lmL异丙醇提取，在492nm下测 定吸光度。
【专利摘要】本发明公开了一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法，该诱导表达以及纯化方法包括：1)重组表达质粒的构建：设计带有EcoR？I和Not？I酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物，进行PCR扩增获得目的基因片段；2)筛选高抗性重组基因工程菌株；3)重组luansin多肽的发酵生产；4)重组luansin多肽的分离纯化：得到纯度为93％的重组lunasin多肽。本发明首次提出使用毕赤酵母表达系统制备lunasin多肽，通过基因工程的方法使luansin多肽的规模化生产可以得以实现。毕赤酵母表达lunasin多肽成本低，产量高，分立纯化步骤简单。
【IPC分类】C12R1/84, C12Q1/02, C07K14/415, C07K1/36, C12N15/66, C07K1/18, C12N15/81, C07K1/34
【公开号】CN105647960
【申请号】
【发明人】任贵兴, 朱莹莹, 顿宝庆, 么杨, 王智
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月28日