有如下有益效果:
[0036] Lunasin是一种含有43个氨基酸的新型多肽,其氨基酸序列为 SKWQHQQQDSCRKQLQGVNLTPCEKmMEKIQGRGDDDDDDDDD。首次从大豆种子中分离鉴定。本发明 首次提出使用毕赤酵母表达系统制备lunasin多肽,通过基因工程的方法使luansin多肽的 规模化生产可以得以实现。毕赤酵母表达lunasin多肽成本低,产量高,分立纯化步骤简单。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明的构建重组表达质粒pPIC9K_lunasin PCR图。
[0038]图2A为本发明的MM培养基表型筛选结果。
[0039]图2B为本发明的MD培养基表型筛选结果。
[0040]图3为本发明的阳性克隆菌PCR鉴定结果。
[0041 ] 图4为本发明的诱导表达产物Trish-Tricine SDS-PAGE蛋白电泳图。
[0042 ]图5A为本发明的重组lunas in多肽对小鼠前体脂肪细胞分化抑制作用图的空白对 照组图。
[0043]图5B为本发明的重组lunasin多肽对小鼠前体脂肪细胞分化抑制作用图的罗格列 酮组图。
[0044] 图5C为本发明的重组lunasin多肽对小鼠前体脂肪细胞分化抑制作用图的重组 lunasin 组-50 图。
[0045] 图5D为本发明的重组lunasin多肽对小鼠前体脂肪细胞分化抑制作用图的重组 lunasin 组-100 图。
[0046] 图6为本发明的重组lunas in多肽HPLC色谱图。
【具体实施方式】
[0047] 下面对本发明的具体实施例进行详细描述,以便于进一步理解本发明。若本发明 未特别指明,实施例均按照常规实验条件以及常规实验手册规定的配方及方法进行。本发 明未特别指明的物质均为来源于普通市面。
[0048] 实施例1
[0049] (1)重组表达质粒的构建
[0050]选择分泌性毕赤酵母表达质粒PPIC9K(市售)作为目的基因表达载体,设计带有 EcoR I和Not 頂每切位点Lunasin序列为GAA TTC TCC AAA TGG CAG CAC CAG CAA GAC AGC TGC CGC AAG CAG CTC CAG GGG GTG AAC CTC ACG CCT TGC GAG AAG CAC ATC ATG GAG AAG ATC CAA GGC CGC GGC GAT GAC GAT GAT GAT GAT GAC GAC GAC GCG GCC CTACTACTACTG CTG CTG CGC CGG。
[0051 ] 设计特异性扩增引物为:上游引物:5 ' -GGAATT CTC CAAATG GCA GCAC-3 ' ;下游引 物:5'-TTG GCC GCG TCG TCG TCATCA TC-3'。进行PCR扩增获得目的基因片段。PCR条件为: 94。〇511^11,941€3〇8,551€3〇8,721€6〇8,35个循环,72。(:1〇11^11。
[0052] 使用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切,将用相同限制性内切酶EcoR I和Not I 双酶切的质粒pP IC9K与酶切后的PCR产物用T4DNA连接酶连接,热激转化到大肠杆菌DH5a中 培养扩增,提取得到重组表达质粒pPIC9K-lunasin。
[0053] 上述酶切体系为:10*buffer 2uL,EcoR I 0.5uL,Not I 0.5uL,载体 10uL/目的基 因 6uL,ddH20 补足 20uL, 37 °C 反应 2h。
[0054] 上述连接体系为:2*buffer 5uL,载体luL,目的基因3.5ul,T4连接酶0.5uL,4°C反 应过夜。
[0055] (2)筛选高抗性重组基因工程菌株
[0056] 将重组表达质粒pPIC9K_lunasin经Sac I线性化酶切(酶切体系为:10*buffer 2uL,重组质粒1 OuL,Sac酶0.5uL,ddH20补足20uL,37 °C反应4h)后,将电击转化入感受态毕 赤酵母GS115细胞获得转化子,将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基,30 °C倒置恒温培 养2-3d,在MD培养及生长良好而在MM培养基上不生长的菌落,挑取进行PCR鉴定,经过PCR鉴 定及G418高抗性筛选,阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K-lunasin。
[0057] 上述电击条件为:电压1.5kv,电容25uF,电阻200Ω,电击时间4-10msec;经酶切线 性化的重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例12yL:80yL混合后进行电击转化。 [0058]上述感受态毕赤酵母GS115制备方法为:从YPD平板上挑取一个新鲜的毕赤酵母 GS115单克隆至10ml YH)液体培养基,30°C,250rpm培养过夜;测定过夜培养物的0D6QQ值为 3.0-5.0之间;将10ml YH)过夜培养物稀释至0D600值为0.2-0.4;在28-30°C摇床中继续培 养8-12h,使其OD600值达到1.0-1.5;于室温1500g离心5min收集酵母细胞,弃上清;用10ml洗 液洗酵母细胞,随后于室温1500g离心5min离心收集细胞,弃上清;用lml山梨醇溶液重悬酵 母细胞,以每管50yl分装。
[0059] (3)重组lunasin多肽的发酵生产 [0060]第一步富集菌体
[0061 ] 将获得的G418高抗性的阳性克隆重组工程菌株GS115/pPIC9K-lunasin接种于 50mL BMGY培养基中。
[0062] 其中,BMGY养基包含:1 %酵母提取物,2 %蛋白胨,1.34 % YNB (无氨基酵母氮源),4 X 10-5 %生物素,1.0 %甘油,10.0 % (v/v)pH6.0磷酸缓冲液。在30°C下培养至0D6QQ值为 2.0-4.0之间(12h_36h),离心(3500rmp,15min)弃上清,收集细胞。
[0063] 第二步诱导表达
[0064] 将收集得到菌体重悬于150ml BMMY培养基中。
[0065] 其中,BMMY培养基包括:1 %酵母提取物,2 %蛋白胨,1.34 % YNB,4 X 10-5 %生物 素,0 · 5 %甲醇,10 · 0 % (v/v)pH6 · 0磷酸缓冲液。使OD600值为1 · 0-2 · 0之间,分别在25°C、28 °C、30°C、32°C条件下诱导表达,每24h补充甲醇至终浓度为0.5%,于12h、24h、36h、48h、 60h、72h分别取2ml发酵液,高速离心(12000rmp,20min)取上清,一部分使用BCA法进行总蛋 白含量测定,另一部分等量上样进行Trish-Tricine SDS-PAGE蛋白电泳,电泳条件为40V 40min,85V 240min,电泳环境保持在4°C。鉴定并比较重组lunasin多肽表达量,筛选表达量 最高菌株及诱导条件。
[0066] (4)重组luansin多肽的分离纯化
[0067] 取500ml经30°C,60h诱导表达的发酵液,高速离心收集上清后,加入1M CaCl2溶 液,使其终浓度为10_20mM,充分混匀后室温静置5min,高速离心得到沉淀经真空冷冻干燥 得到重组lunasin多肽粗产物。
[0068] 将该粗产物以浓度为10mg/mL溶解,过DEAE阴离子交换柱,上样量为5mL,平衡液为 含有EDTA(乙二胺四乙酸)的pH6.8PBS(磷酸缓冲液),流速4mL/min,洗脱液为1M NaCl浓度 梯度30%-50%,每81111^收集一管。经Trish-Tricine SDS-PAGE蛋白电泳,收集lunasin多肽 富集洗脱液,合并后过过lOKDa超滤膜,收集滤出液,再过lKDa超滤膜,收集浓缩液。浓缩液 经真空冷冻干燥后得到纯化的重组lunasin多肽。如图6所示,纯化的重组lunasin多肽经 即^:检测纯度为93%以上。
[0069] HPLC检测条件为:分离柱为C18(4.6mm*250mm,5um),检测器为UV检测器,检测波长 为215nm,流速为lmL/min,A相0.1%三氟乙酸水溶液3相为0.1%三氟乙酸乙腈,线性梯度: B相 15%~35%,20min。
[0070] 实施例2重组lunasin多肽的生理活性鉴定
[0071] 3T3-L1前体脂肪细胞以10000个细胞/mL密度接种于12孔板,生长融合后,再培养 48h,加诱导液I,所述诱导液I为包含10%FBS,1%双抗,10μg/ml胰岛素,0.5mM IBMX(3-异 丁基-1-甲基黄嘌呤)和0. ΙμΜ DEX(地塞米松)的DMEM培养基培养;培