转化之后细胞悬浮液的荧光值；
(3)目的基因的体外扩增:
突变株的构建是通过同源双交换实现的，在敲除基因的同时引入潮霉素B抗性基因，抗性基因两侧是待敲除基因的上游和下游片段，采用细菌基因组提取试剂盒提取隐甲藻ATCC 30556基因组作为模板，隐甲藻18S的上游的上、下游引物；隐甲藻18S的下游的上、下游引物；进行PCR扩增，得到隐甲藻18S的上游片段和下游片段；用18s上游片段的上游引物和18s下游片段的下游引物，以上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段为模板进行融合 PCR;
步骤为:取隐甲藻 ATCC 30556 基因组溶液 10 ng, 5 XPhus1n HF buffer 4 μ1，10μΜ 的 dNTP0.4 μ1，10 μΜ 上游引物 1μ1、10 μΜ 下游引物 I μ 1，Phus1n 酶 0.2 μ I,无菌水12.4 μ 1，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C30 s ；98°C 10 s，55°C 30 s，72°C 30 s，共 30 个循环，4°C 5 min，将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻ATCC 30556 18S的上游片段；
取隐甲藻 ATCC 30556 基因组溶液 10 ng，5XPhus1n HF buffer 4μ1，10μΜ 的dNTP0.4μ1,10μΜ 上游引物 1μ1、10μΜ 下游引物 I μ?，Phus1n 酶0.2 μ?，无菌水12.4 μ 1，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C 30s ;98°C 10s，55°C 30s, 72°C 30s，共30个循环，4°C 5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的下游片段；
取 PCAMBIA1301 植物表达载体溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的dNTP 0.4 μ 1,10 μΜ 上游引物 I μ1、10 μΜ 下游 I μ 1，Phus1n酶0.2 μ?，无菌水 12.4μ 1，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C 30 s ；98°C10 s，55°C 30 s’72V 40 s，共30个循环，4°C 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；
以上游片段、潮霉素B抗性片段(Hpt片段)、下游片段为模板进行融合PCR，步骤为:各取上游片段、下游片段、Hpt片段各10 ng为模板，5XPhus1n HF buffer 4 μ1，10 μΜ的dNTP 0.4 μ 1，Phus1n 酶 0.2 μ 1，无菌水 10.4 μ?，以 10 μΜ 上游引物 I μ1、10 μΜ下游引物I μ 1，在PCR管中混匀。将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C30 s ；98°C 10 s，60°C 90 s，72°C 30 s，共 30 个循环，4°C 5 min，将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段(上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段融合PCR产物)；
(4)外源目的基因片段对隐甲藻ATCC 30556的转化；
无菌条件下，接种隐甲藻ATCC 30556菌液于液体C9N2培养基中，取悬浮培养48 h的细胞 10 mL, 4°C, 3500 rpm离心 5 min，弃上清，加入 I mL 25 mM DTT溶液，30°C水浴 15 min,离心5 min，弃上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，I mL山梨糖醇重悬细胞备用，在无菌条件下去200 μ I隐甲藻感受态细胞至于2 μπ?电极杯中，加入I μ I鲑鱼精DNA和2 μ g目的片段混匀，冰浴5 min,电击转化条件为2.0 kV，电阻200 Ω，电容25μ F，电击之后冰浴5 min,加入2 mL新鲜C9N2培养基25°C，180 rpm震荡复苏48 h，取50μ I细胞悬浮液均匀图涂布在含有40 mg/L潮霉素B的C9N2固体平板上，倒置培养2周，将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛，待长出单克隆细胞，转接液体培养。
[0019]所述液体培养基C9N2:葡萄糖9 g，酵母浸粉2 g，海盐25 g，加水至I L ;
所述固体培养基C9N2:葡萄糖9 g，酵母浸粉2 g，海盐25 g，琼脂粉15 g加水至I L。
[0020]实施例2
本实施例与实施例1基本相同，只是电击转化设置电压为1.6 kV。
[0021]实施例3
本实施例与实施例1基本相同，只是电击转化设置电压1.8 kV。
[0022]实施例4
本实施例与实施例1基本相同，只是电击转化设置电压2.0 kV。
[0023]实施例5
本实施例与实施例1基本相同，只是电击转化设置电压2.2 kV。
[0024]实施例6
本实施例与实施例1基本相同，只是电击转化设置电压2.4 kV。
[0025]实施例7
本实施例与实施例1基本相同，只是使用的菌株为隐甲藻ATCC 30772。
[0026] 综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
【主权项】
1.一种对隐甲藻进行基因转化的方法，其特征是包含如下步骤: 隐甲藻敏感抗生素潮霉素B作用浓度的确定: 培养基的配制: 在C9N2培养基(葡萄糖9 g，酵母浸粉2 g，海盐25 g，加水至I L)中对潮霉素B设置浓度梯度，10 mg/L- 50 mg/L ； 潮霉素B敏感浓度的确定: 隐甲藻在25°C，180 rpm条件下振荡培养48 h，取50 μ I细胞悬浮液均匀涂布在5个梯度平板上，25°C倒置培养2周(无抗平板培养作为阳性对照)，最终确定隐甲藻对潮霉素B敏感浓度为40 mg/L ; 转化体系的建立: 隐甲藻感受态细胞的制备: 取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10 mL，4°C, 3500 rpm离心5 min，弃上清，加入I mL 25mM DTT溶液，30°C水浴15 min，离心5 min，弃上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，I mL山梨糖醇重悬细胞备用； 焚光标记大分子FITC-Dextran (70 kDa)的转化: 在无菌条件下取200 μ I隐甲藻感受态细胞至于2 μπ?电极杯中，加入I μ I鲑鱼精DNA和2 yg FITC-Dextran混匀，冰浴5 min，其中不加入FITC-Dextran的作为阴性对照，加入FITC-Dextran但不电击的作为阳性对照，设置电压1.4 kV，1.6 kV ,1.8 kV，2.0 kV，2.2 kV和2.4 kV，电阻200 Ω，电容25和50 μ F进行电击转化，电击结束之后在冰上冰浴5 min，用2 mL C9N2培养基重悬细胞并加入胰蛋白酶37°C培养30 min，荧光显微镜镜检细胞，观察是否有发绿色荧光的细胞，荧光分光光度计测定转化之后细胞悬浮液的荧光值；通过比较细胞悬浮液之间荧光值的差异最终确定电击转化条件为电压2.0 kV，电阻200Ω，电容 25 μ F ； 外源基因片段的准备: 隐甲藻18S上游片段的扩增: 取隐甲藻基因组溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的 dNTP 0.4 μ 1,10μ M上游引物I μ 1、10 μ M下游引物I μ I，Phus1n酶0.2 μ 1，无菌水12.4 μ?，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C 30 s ；98°C 10 s’55°C 30 s’72V 30 s，共30个循环，4°C 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的上游片段； 隐甲藻18S下游片段的扩增: 取隐甲藻基因组溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1，10 μ M 的 dNTP 0.4 μ 1,10μΜ上游引物I μ1、10 μΜ下游I μ I，Phus1n酶0.2 μ 1，无菌水12.4 μ 1，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C 30 s ；98°C 10 s，55°C 30s，72°C 30 s，共30个循环，4°C 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的下游片段； 潮霉素抗性基因(如?)的扩增 取 PCAMBIA1301 植物表达载体溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的dNTP 0.4 μ 1,10 μΜ 上游引物 I μ1、10 μΜ 下游 I μ 1，Phus1n酶0.2 μ?，无菌水 12.4μ 1，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C 30 s ；98°C10 s，55°C 30 s’72V 40 s，共30个循环，4°C 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段； 用于同源双交换整合的基因片段的构建: 取已获得的隐甲藻18s上游片段、18s下游片段、以及Hpt片段各10 ng为模板，5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的 dNTP 0.4 μ 1，Phus1n 酶 0.2 μ 1，无菌水 10.4μ?，以10 μΜ上游引物I μ1、10 μΜ下游引物I μ 1，在PCR管中混勾，将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C 30 s ；98°C 10 s，60°C 90 s，72°C 30 s，共30个循环，4°C 5 min;将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段(上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段融合PCR产物)； 外源目的基因片段对隐甲藻的转化； 隐甲藻感受态细胞的制备: 取隐甲藻悬浮培养48 h的细胞10 mL, 4°C, 3500 rpm离心5 min，弃上清，加入I mL25 mM DTT溶液，30°C水浴15 min，离心5 min，弃上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，I mL山梨糖醇重悬细胞备用； 外源目的基因片段的转化: 在无菌条件下取200 μ I隐甲藻感受态细胞至于2 μπ?电极杯中，加入I μ I鲑鱼精DNA和2 μ g目的片段混匀，冰浴5 min,电击转化条件为2.0 kV，电阻200 Ω，电容25μ F，电击之后冰浴5 min,加入2 mL新鲜C9N2培养基25°C，180 rpm震荡复苏48 h，取50μ I细胞悬浮液均匀图涂布在含有40 mg/L潮霉素B的C9N2固体平板上，倒置培养2周，将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛，待长出单克隆细胞，转接液体培养，并对转化子进行确定。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的菌种为隐甲藻属。
【专利摘要】本发明公开了一种生产二十二碳六烯酸隐甲藻敏感的抗生素潮霉素B，以及利用潮霉素B做为抗性筛选标记，对隐甲藻进行基因转化的方法；该方法包括下述步骤：（1）隐甲藻敏感抗生素潮霉素B作用浓度的确定；（2）基因转化系统的建立；（3）外源基因片段的准备；（4）外源基因片段对隐甲藻的转化。利用本发明可以将外源基因导入隐甲藻细胞中，同时使用潮霉素B作为筛选标记，得到外源基因转化入隐甲藻后的工程菌株。该方法为开展隐甲藻的基因工程改造提供了重要的技术基础。
【IPC分类】C12N15/79, C12R1/89
【公开号】CN105647956
【申请号】
【发明人】刘璐, 刁进进, 陈磊, 张卫文
【申请人】昆明藻能生物科技有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2015年4月20日