一种对生产二十二碳六烯酸隐甲藻进行基因转化的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种对生产二十二碳六烯酸隐甲藻进行基因转化的方法。
【背景技术】
[0002]二十二碳六稀酸(Docosahexaenoic Acid, DHA)是人脑发育、成长的重要物质之一，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50%。因此，它对胎儿和婴幼儿的大脑和视网膜的发育，以及成年人脑功能的维修等方面有着重要的作用。此外，DHA对冠心病、中风、高血压等心血管系统的疾病、神经失常、老年痴呆症和抑郁症等神经系统的疾病也有积极的影响。DHA作为一种必需脂肪酸，其增强记忆与思维能力、提高智力等作用更为显著。人群流行病学研究发现，体内DHA含量高的人的心理承受力较强，智力发育指数也高。DHA还可用于癌症治疗，抑制发炎等。据荷兰帝斯曼公司的估计，DHA的全球市场价值约为25-26.2亿美元，并且以每年15%以上的速度增长。
[0003]截止目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源存在诸多缺点，比如海洋污染造成的对鱼油安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同，含EPA、易受环境污染、纯化成本高，鱼油的特殊气味也限制了鱼油来源的DHA作为一种食品添加剂的应用。尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的孩子，其可能的不利影响更令人担忧；此外，世界渔业资源的逐年萎缩对DHA的可持续性供应的影响也值得考虑。
[0004]利用隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)发酵生产DHA，与传统鱼油来源相比，具有一系列优点，如发酵周期短，培养方式简单，微生物生长快，易于大规模培养；多不饱和脂肪酸含量高，产品质量稳定，氧化稳定性较好，不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含量低，易于分离纯化；同时克服了传统的从鱼油中获取DHA受原料、气候、产地、生产周期等诸多限制因素的影响。因此微生物发酵生产DHA可替代鱼油来源的DHA，具有广泛的应用前景。
[0005]鉴于隐甲藻发酵生产DHA的优势，有必要发展相关的分子生物学技术对其体内积累油脂的代谢途径及其调控进行深入的研究，同时发展相关的基因工程改造策略以进一步提高隐甲藻合成DHA的产率。然而，目前针对隐甲藻尚缺乏有效的基因转化手段，使得相关的研究和提高产率的工作无法进行。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种针对隐甲藻敏感的抗生素，以及提供一种对隐甲藻进行基因转化的方法。
[0007]本发明的技术方案如下:
(O隐甲藻敏感抗生素潮霉素B作用浓度的确定: ①培养基的配制:
在C9N2培养基(葡萄糖9 g，酵母浸粉2 g，海盐25 g，加水至I L)中对潮霉素B设置浓度梯度，10 mg/L- 50 mg/L ；
②潮霉素B敏感浓度的确定:
隐甲藻在25°C，180 rpm条件下振荡培养48 h，取50 μ I细胞悬浮液均匀涂布在5个梯度平板上，25°C倒置培养2周(无抗平板培养作为阳性对照)，最终确定隐甲藻对潮霉素B的敏感浓度为40 mg/L ;
(2)基因转化体系的建立:
①隐甲藻感受态细胞的制备:
取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10 mL, 4°C, 3500 rpm离心5 min，弃上清，加入I mL 25mM DTT溶液，30°C水浴15 min，离心5 min，弃上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，I mL山梨糖醇重悬细胞备用；
②焚光标记大分子FITC-Dextran(70 kDa)的转化:
FITC-Dextran (70 kDa)是一种荧光标记的大分子物质，在进入细胞内部之后能够自发绿色荧光使细胞带有绿色荧光标记。因此，为了验证隐甲藻感受态细胞的转化效率和确定最佳的电击条件，选择焚光标记的大分子聚合物FITC-Dextran (70 kDa)作为转化的分子。在无菌条件下取200 μ I隐甲藻感受态细胞至于2 μπ?电极杯中，加入I μ I鲑鱼精DNA和2 μ g FITC-Dextran混勾，冰浴5 min，其中不加入FITC-Dextran的作为阴性对照，加入FITC-Dextran但不电击的作为阳性对照，设置电压1.4 kV，1.6 kV，1.8 kV，2.0 kV，
2.2 kV和2.4 kV，电阻200 Ω，电容25和50 μ F进行电击转化，电击结束之后在冰上冰浴5 min，用2 mL C9N2培养基重悬细胞并加入胰蛋白酶37°C培养30 min，荧光显微镜镜检细胞，观察是否有发绿色荧光的细胞，荧光分光光度计测定转化之后细胞悬浮液的荧光值。通过比较细胞悬浮液之间荧光值的差异最终确定电击转化条件为电压2.0 kV，电阻200 Ω，电容25 μ F ；
(3)外源基因片段的准备:
①隐甲藻18S基因上游片段的扩增:
取隐甲藻基因组溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的 dNTP 0.4 μ I,10 μΜ上游引物I μ1、10 μΜ下游引物I μ?，Phus1n酶0.2 μ?，无菌水12.4 μ I,在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C 30 s ;98°C 10s，55°C 30 s’72V 30 s，共30个循环，4°C 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的上游片段；
②隐甲藻18S基因下游片段的扩增:
取隐甲藻基因组溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的 dNTP 0.4 μ I,10 μΜ 上游引物 I μ1、10 μΜ 下游 I μ I，Phus1n 酶 0.2 μ?，无菌水 12.4 μ?，在 PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C 30 s ；98°C 10 s，55°C30 s，72°C 30 s，共30个循环，4°C 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的下游片段；
③潮霉素抗性基因(如?)的扩增
取 PCAMBIA1301 植物表达载体溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的dNTP 0.4 μ 1,10 μΜ 上游引物 I μ1、10 μΜ 下游 I μ 1，Phus1n酶0.2 μ?，无菌水 12.4μ 1，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C 30 s ；98°C10 s，55°C 30 s’72V 40 s，共30个循环，4°C 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；
④用于同源双交换整合的基因片段的构建:
取扩增后的隐甲藻18s上游片段、18s下游片段、以及Hpt片段各10 ng为模板，5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的 dNTP0.4 μ 1，Phus1n 酶 0.2 μ 1，无菌水 10.4μ?，以10 μΜ上游引物I μ1、10 μΜ下游引物I μ 1，在PCR管中混勾，将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为:98°C 30 s ；98°C 10 s，60°C 90 s，72°C 30 s，共30个循环，4°C 5 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段(上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段融合PCR产物)；
(4)外源目的基因片段对隐甲藻的转化；
①隐甲藻感受态细胞的制备:
取隐甲藻悬浮培养48 h的细胞10 mL, 4°C, 3500 rpm离心5 min，弃上清，加入I mL25 mM DTT溶液，30°C水浴15 min，离心5 min，弃上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，I mL山梨糖醇重悬细胞备用；
2外源目的基因片段的转化:
在无菌条件下取200 μ I隐甲藻感受态细胞至于2 μπ?电极杯中，加入I μ I鲑鱼精DNA和2 μ g目的片段混匀，冰浴5 min,电击转化条件为2.0 kV，电阻200 Ω，电容25μ F，电击之后冰浴5 min,加入2 mL新鲜C9N2培养基25°C，180 rpm震荡复苏48 h，取50μ I细胞悬浮液均匀图涂布在含有40 mg/L潮霉素B的C9N2固体平板上，倒置培养2周，将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛，待长出单克隆细胞，转接液体培养。通过基因组PCR对转化子进一步验证。
[0008]本发明的有益效果是:本发明通过抗生素耐性实验，鉴定出一种隐甲藻敏感的抗生素潮霉素B，采用潮霉素B作为筛选标记建立了有效的隐甲藻转化体系，这对开展针对隐甲藻的基因工程改造，进而提高DHA产率有着现实的应用价值。
[0009]
【附图说明】
[0010]图1为隐甲藻在不同潮霉素浓度下的生长。
[0011]图2为电击转化FITC-Dextran荧光显微镜检测转化细胞的图。(左边为明视野下的隐甲藻细胞，右边为该细胞在暗视野下发荧光)。
[0012]图3为抗潮霉素B的突变株和野生株在潮霉素B抗性平板上生长状况的对照图(其中，5#是第一轮初筛得到的转化子，WT为野生型隐)。
[0013]图4为转化后的突变株的PCR鉴定图(其中，M是DNA Maeker III ;分别用野生型(1、
2泳道)和5#突变株(3、4泳道)的基因组模板做PCR ；18s用作PCR阳性对照)。
[0014]
【具体实施方式】
[0015]下面的实施例是为了本领域的技术人员更好地理解本发明但不用于限制本发明。
[0016]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0017]实施例1
一种对隐甲藻ATCC 30556进行基因转化的方法，包括下述步骤:
(O隐甲藻ATCC 30556敏感抗生素潮霉素B作用浓度的确定:
隐甲藻ATCC 30556敏感抗生素潮霉素B作用浓度的确定是通过抗生素浓度梯度实现的；
步骤为:在C9N2培养基中对潮霉素B设置浓度梯度，10 mg/L- 50 mg/L。隐甲藻在25°C, 180 rpm条件下振荡培养48 h，取50 μ I细胞悬浮液均匀涂布在5个梯度平板上，25°C倒置培养2周(无抗平板培养作为阳性对照)；最终确定隐甲藻ATCC 30556对潮霉素B敏感浓度为40 mg/L ο
[0018](2)隐甲藻ATCC 30556感受态细胞的制备及荧光标记大分子FITC-Dextran (70kDa)的转化:
隐甲藻ATCC 30556感受态细胞的制备是通过DTT溶液预处理细胞，使细胞的细胞壁变薄，通过高渗透压的山梨糖醇溶液的反复洗涤去掉细胞悬浮液中混有的其他离子，保证电击的效率；
步骤为:取隐甲藻ATCC 30556悬浮培养48 h的细胞10 mL, 4°C, 3500 rpm离心5 min,弃上清，加入I mL 25 mM DTT溶液，30°C水浴15 min，离心5 min，弃上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，I mL山梨糖醇重悬细胞备用；
在无菌条件下取200 μ I隐甲藻ATCC 30556感受态细胞至于2 μπ?电极杯中，加入Iμ I娃鱼精DNA和2 μ g FITC-Dextran混勾，冰浴5 min，其中不加入FITC-Dextran的作为阴性对照，加入FITC-Dextran但不电击的作为阳性对照，设置电压1.4 kV，电阻200 Ω，电容25 μ F进行电击转化，电击结束之后在冰上冰浴5 min，用2 mL C9N2培养基重悬细胞并加入胰蛋白酶37°C培养30 min，荧光显微镜镜检细胞，观察是否有发绿色荧光的细胞，荧光分光光度计测定