增5'端侧翼序列的过程如图3所示。在核心序列内部设计3个引物： Sp5-1、Sp5-2、Sp5-3,这三个引物的距离依次接近5'端。首先使用引物Sp5-1与简并引物 LAD1进行一次预扩增（Pre-amplification)，接下来以预扩增的产物为模板，用引物Sp5-2 和AC1进行一次扩增（Primary)，最后用Sp5-3和AC1引物，以一次扩增PCR产物为模板进 行二次扩增（Secondary)。3'端扩增采用相同的步骤。核心序列内进行Tail-PCR设计扩 增木聚糖酶基因上游和下游引物如表2所示。
[0052] 表2侧翼序列所用到的引物
[0053] Table 2. Primers for Flanking secqence
[0054]
[0055] 注：R = A/G，S = C/G，W = A/T，B = C/G/T，N = A/C/G/T
[0056] 预扩增使用Sp3_l，LAD1，以预扩增反应产物为模板，使用引物Sp3_2和AC1进行 一次扩增，电泳检测发现，通过一次扩增已经能获得特异性较高的条带（图4)。图中可以看 到泳道2和泳道4分别出现了 lOOObp和2000bp大小的两条亮带，切胶回收，连T克隆载体 测序。得到3'端侧翼序列xynA-3'。
[0057] Sp5-l、Sp5-2特异性引物分别于与LADUAC1引物配对，Sp3-2、Sp5-3特异性引物 分别于与LADUAC1引物配对，进行HiTail-PCR，通过两轮反应即获得了特异性较好的条带 (图5)。图中泳道1，3分别出现了大小约为1200bp左右的亮带，切胶回收，连T克隆载体 测序，得到5'端侧翼序列xynA-5'。
[0058] 回收电泳中亮度高的条带，连接T载体，通用引物M13测序，分别得到3'端、5'端 的侧翼序列，因为特异性引物是在核心序列内部设计得到，这样侧翼序列会和核心序列有 一段是重叠的，用DNAMAN软件分析找到这些重叠序列，进而将三段基因拼接到一起，最终 得到一段长为1383bp基因全长序列SEQ-1。
[0059] 实施例2 :重组木聚糖酶Xyn A蛋白分析
[0060] 2. lpET28a(+)表达载体的构建：
[0061] 2. 1. 1PCR 扩增基因 xynA
[0062] 根据xynA设计引物，综合考虑表达载体的多克隆位点（MCS)和xynA序列，在xynA 两端引入酶切位点EcoR I和Xho I。PCR反应体系参考表2. 1。PCR循环条件为：94°C， 4min ;94°C，30s ;68°C，30s ;72°C，90s ;共 30 个循环，最后 72°C延伸 10min。PCR产物切胶回 收。引物由北京奥科鼎盛公司合成，引物见表3。
[0063] 表3克隆xynA的引物
[0064] Table 3 Primers for xynA
[0065]
[0066] 2· 1· 2 重组质粒 pET28a_xyn4 的构建
[0067] 将表达载体pET28a和带有酶切位点的xynA用EcoR I和Xho I分别进行双酶切， 37°C温浴4h。切胶回收xynA和切开的表达载体。T4DNA连接酶连接xynA和线性pET28a (+)， 摩尔比3 : 1，16°C中连接12h，获得大肠杆菌表达质粒pET28a-xynA。按《分子克隆实验指 南第三版》中所述方法热激转化大肠杆菌DH5a菌株"转化得到的阳性克隆用于培养及木聚 糖酶表达。
[0068] 2. 2重组Xyn A酶分析
[0069] 2. 2. 1同源性比对
[0070] 在NCBI上对xynA序列进行BLAST比对，共找到51条与xynA同源性在70%以上 的序列（图6)，相比较同源性较高的是来自菌株Streptomyces megasporus(HM003041. 1)， Streptomyces halstedii (U41627. 1), Streptomyces chattanoogensis (AF121864. 2)木聚 糖酶的基因，同源性分别达到81%，81%和74%，而且和木聚糖酶的同源性最高，说明该基 因也是木聚糖酶，另一方面说明该基因比较新颖，具有较高的研究价值。
[0071] 2. 2. 2信号肽预测
[0072] 将xynA翻译成为氨基酸序列，通过在线信号肽预测网站（http ://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP)对其进行分析，结果见图7,信号肽序列预测结果表明该酶是一个 具有信号肽的分泌蛋白。
[0073] 2. 2. 3氨基酸保守功能区分析
[0074] 蛋白质保守功能区分析采用蛋白质保守序列（⑶D)数据库（http ://www. ncbi. nlm. nih. Gov/structure/cdd/cdd. shtml.)来预测，结果见图8,表明该酶具有典型的第10 族糖苷水解酶保守区域的典型结构。
[0075] 此外，该基因还编码一段大小为10kDa的纤维素结合域（CBD)。去掉CBD区域，木 聚糖酶分子量大小为34kDa。
[0076] 对木聚糖基因全长xynA进行生物信息学分析，xynA全长共有1393碱基对，G， C含量占68 %。DNAMAN软件分析，该基因能编码460个氨基酸如SEQ-2,预测分子量约为 48. 2kDa，等电点pi为9. 04。且含有一段信号肽序列为SEQ-3。去掉该信号肽序列，剩余氨 基酸分子量约为43. 6kDa，等电点pi = 8. 19,与天然菌株产的一个约44kDa的木聚糖酶大 小相同。分析蛋白质保守序列，结果表明该酶具有F/10糖苷水解酶的典型结构，并能翻译 一段大小为10kDa的纤维素结合域，肽序列为SEQ-4。去掉CBD区域，木聚糖酶分子量大小 为 34kDa。
[0077] 2. 2. 4木聚糖酶活性分析
[0078] 粗粗酶液经硫酸铵分级沉淀、CMSFF柱层析进行纯化，得到了电泳纯分子量为 44kDa的木聚糖酶，该过程中蛋白质、总酶活力、比活力、纯化倍数及回收率的变化见表 4. 3,经过40%~80%的硫酸铵沉淀，木聚糖酶纯化了 2. 6倍，回收到总酶活的82. 9%。经 过层析柱CMSFF后纯化了 3. 79倍，回收到5. 3%的酶活。
[0079] 各步的纯度电泳图及酶谱图见图9。经过两步纯化在分子量为44kDa的地方得到 电泳纯的蛋白。酶谱分析显示，此条带具有木聚糖酶活性。
[0080] 大肠杆菌重组子诱导产酶后经过超声破壁，使得木聚糖酶溶解到上清中采用DNS 法测定木聚糖酶活力。具体操作如下：用0. 05M，pH值为5. 3的柠檬酸缓冲液稀释上清液 样品，取100pl样品加入至900pll%的桦木木聚糖底物中，于55°C反应smin，加入lml的 DNS反应终止液，于沸水中显色15min，加入1ml40%的酒石酸钾钠溶液，于540nm下测定吸 光度，计算得到木聚糖酶酶活。DNS法测的该酶活力为19. 7±1. 2U/mL。
【主权项】
1. 一种木聚糖酶的核苷酸序列，其序列细节为SEQ-1。2. 这个序列的至少90 %的同源。3. -种木聚糖酶的多肽，其序列细节为SEQ-2。4. 这个序列的至少90 %的同源。5. -种木聚糖酶的信号肽，其序列细节为SEQ-3。6. 这个序列的至少90 %的同源。7. -种木聚糖酶的纤维素结合域（CBD)，其序列细节为SEQ-4。8. 这个序列的至少90 %的同源。9. 包含权利1，2, 3,4, 5,6, 7,8的重组载体。10. 权利9的大肠杆菌的重组表达系统。11. 类似于权利10在乳酸杆菌，酿酒酵母，芽孢杆菌（如枯草芽孢杆菌），曲霉（如黑 曲霉或者米曲霉）中的表达应用。12. 权利1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11在造纸工业，食品加工，纺织工业，饲料工业，生物 能源，化妆品，医药保健品，以及各种生物反应器的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种来源于教酒链霉菌(Streptomyces？chartreusis？L1105)的木聚糖酶Xyn？A的基因，包括其核酸和蛋白质/多肽序列。该基因编码的木聚糖酶全长共有1393个碱基对，G，C含量占68％，编码460个氨基酸，分子量约为48.2kDa，等电点pI为9.04。含有一段信号肽序列。该酶具有F/10糖苷水解酶的典型结构，能翻译一段大小为10kDa的纤维素结合域(CBD)。DNS法测得该酶活为19.7±1.2U/mL。作为一种碱性的木聚糖酶，该酶及其作用产物具备在造纸工业，纺织工业，食品加工，生物能源，饲料工业，化妆品，医药，保健品，酿酒，农作物生产，以及各类生物反应器中的应用价值。
【IPC分类】C12N15/63, C12N9/42, C12N15/56, C12N1/21, C12N1/19, C12N1/15, C12R1/52
【公开号】CN105647944
【申请号】
【发明人】李秀婷, 熊科, 朱运平, 滕超, 闫子祥
【申请人】李秀婷, 熊科, 朱运平
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年12月11日