rtreusis L1105)的木聚糖酶获 得木聚糖酶基因信号多肽序列如SEQ-3所示：
[0014] MATRTSIDPPPERRPRRSRVRTALALGLAGLLGATGVGALTGTAQA
[0015] 本发明从来源于教酒链霉菌（Streptomyces chartreusis L1105)的木聚糖酶获 得木聚糖酶基因纤维素结合域（CBD)多肽序列如SEQ-4所示：
[0016] SKAEEWSDRFNGKVTITAGSSAISAWTVNVTVNSPQKVSTTWNGTPSffDSSGNVMTMKSNGNGSLAAGA STSFGFTVMKNGSSATPAIGSCTAS*
【附图说明】
[0017] 图1是教酒链霉菌基因组总DNA图。
[0018] 图2是编码木聚糖酶的保守序列图。
[0019] 图3是HiTail-PCR过程简图。
[0020] 图4是基因 SEQ-1的:V端侧翼序列电泳图。其中M :marker ;1 :LAD1/SP3-1预扩 增，AC1/SP3-2 为一轮扩增；2 :LAD2/SP3-1 预扩增，AC1/SP3-2 为一轮扩增；3 :LAD3/SP3-1 预扩增，AC1/SP3-2为一轮扩增；4 :LAD4/SP3-1预扩增，AC1/SP3-2为一轮扩增。
[0021] 图5是基因 SEQ-1的Y端侧翼序列电泳图。其中M，marker ;1，LAD1/SP5-2为 第一轮扩增，AC1/SP5-3为第二轮扩增；2, LAD3/SP5-2为第一轮扩增，AC1/SP5-3第二轮扩 增；3, LAD1/SP5-1为第一轮扩增，AC1/SP5-2为第二轮扩增；3, LAD3/SP5-1为第一轮扩增， AC1/SP5-2为第二轮扩增。
[0022] 图6是xynA核酸数据库同源性比较图。
[0023] 图7是Xyn A酶信号肽预测图。
[0024] 图8是氨基酸保守功能区图。
[0025] 图9是教酒链霉菌L1105纯化过程的电泳（a)及酶谱（b)图。其中M，蛋白标样； 1，粗酶液的蛋白带；2,50-80%硫酸铵盐析所得的蛋白带；3,纯酶；4,粗酶液酶谱；5,盐析 后样品酶谱；6,纯酶酶谱
【具体实施方式】
[0026] 本发明以下结合具体实例作进一步说明，但并不是限制本发明。下面结合附图对 本发明进一步说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条，如J.萨姆布 鲁克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南第三版》中所述的条件，或按照试剂盒生产 商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。 [0027] 普通试剂：刚果红；卡那霉素（美国AMRESC0);琼脂糖（西班牙Biowest);氨苄青 霉素（美国AMRESC0);桦木木聚糖（美国Sigma) ;LB固体培养基；木聚糖-刚果红筛选平 板；NaCl洗脱液：1M。
[0028] 生化试剂：细菌基因组提取试剂盒（美国OMEGA);胶回收试剂盒（OMEGA，美国）； La Taq DNA 聚合酶（with GC buffer);限制性内切酶 EcoR I、Xho I;lkb DNA Ladder Marker (日本 TAKARA) ;La Taq DNA 聚合酶（with GC buffer) (TAKARA，日本）；200bp DNA ladder (美国Biomega) ;PCR扩增引物（北京奥科鼎盛合成）；200bp DNA ladder (美国 Biomega)
[0029] 菌株：教酒链霉菌（Streptomyces chartreusis)L1105 ;大肠杆菌 DH5a 和 Transtetta(DE3)感受态细胞购自全式金公司
[0030] 载体：T 载体：pMD18-T 购于 TAKARA 公司；pET-28a (+)购自 Merk 公司
[0031] T载体用测序引物：
[0032] M13+序列：5' -GTTTTCCCAGTCACGAC-3'
[0033] M13-序列：5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3'
[0034] 实施例1 :教酒链霉菌（Streptomyces chartreusis L1105)的木聚糖酶Xyn A的 基因克隆
[0035] 1 · 1基因组DNA提取
[0036] 将教酒链霉菌L1105接种于LB液体培养基中，30°C，150rpm培养72h，吸取菌液 1. 5mL置于2mL离心管中lOOOOXg室温离心5min，得到菌体。提取细菌基因组，得到教酒 链霉菌（Streptomyces chartreusis L1105)的木聚糖酶基因组总DNA(图1)。
[0037] 1.2简并引物设计
[0038] 在 NCBI 蛋白数据库（http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/)中输入木聚糖酶 N 端 15 个氨基酸序列 ASTLGAAAAEKGRYF (Ala-Ser-Thr-Leu-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Glu-Lys-Gly-A rg-Tyr-Phe)进行Blastn比对，获得与教酒链霉菌L1105木聚糖酶基因同源性较高的来源 于链霉菌属的10条编码木聚糖酶的基因序列，在高同源性区域内设计引物。分析得到该类 木聚糖酶的保守序列区（图2)。
[0039] 1. 3PCR 扩增核心序列（xynA-Core)
[0040] 以基因组为模板，通过保守区域设计引物进行PCR(表1)。PCR反应条件：PCR反应 条件：94°C，4min (预变性）；94°C，30s (变性），62°C，30s (褪火），72°C，60s (延伸），30 个 循环；72°C延伸10min。
[0041] 表1简并引物序列
[0042] Tablel Primers for xynA-core
[0043]
[0045] 注：R = A/G，S = C/G，W = A/T，B = C/G/T，N = A/C/G/T
[0046] 根据两个引物之间的距离估计PCR产物的大小，挑选大小合适条带进行胶回收。 连接到T载体pMD18-T上，将上述转化的后的阳性DH5a克隆接种于lml的LB培养基，交上 海生工生物技术公司进行DNA序列测定，，使用通用测序引物M13+和M13-，测序获得到一个 约450bpDNA核心序列片段。然后核酸序列在NCBI上进行比对，结果表明序列与登录号为 HE971709. 1，AF194024，AB110643. 1木聚糖酶基因序列具有很高的同源性，初步确定得到的 核心序列能编码木聚糖酶，为木聚糖酶核心序列（xynA-core)。
[0047] >xynA~Core
[0048] CACCTGGGGGAGAGCGCGTACGTCTCGACGCTCAACACCGAGTTCAACTCGGTGACCCCGGAGAACGAG ATGAAGTGGGACGCCACCGAGCGCACCCGCGGCACCTTCACCTTCGGCTCCGCCGACCAGGTCGTGAACCACGCCCA GAGCCAGGGCATGAAGGTCCGCGGCCACACCCTGGTCTGGCACTCGCAGTTACCGAGCTGGGTCGCGGGACTCGGCA CCGCCGACCTCAGATCGGCGATGAACAATCACATCACCCAGGTCATGCAGCACTACAAGGGCAAGATCCACTCCTGG GACGTCGTCAACGAGGCATTCCAGGACGGCAGCAGTGGTGCGCGGCGCAGCTCGCCCTTCCAGGACAAGCTCGGCAA CGGCTTCATCGAGGAGGCGTTCCGCACCGCCCGGGCCGCCGACCCGGCCGCCAAGCTCTGCTACAACGACTACAACA CCGACGGCGTCAACGCGAAGAGCAATGCCGTCTACAACCTGGTCAGGGACTTCAAGTCCCGTGGCGTGCCGATCGAC TGCGTGGGCTTCCAGTCCCACTTCAACAGCGCCTCGCCGGTCCCCTCCGACTACCAGGCCAACCTCCAGCGCTTCGC CGACCTCGGCGTGGACGTGCAGATCACCGAGCTGGACATCGAGGGCTCGGGCACCGCACAGGCCAACAGCTACACCA ATGTGGTCCGCGCCTGTCTGGCCGTCTCGCGCTGCACCGGCATCACCGTCTGGGGCGTCACCGACAAGTACTCCTGG CGCGCGAGCGGAACGCCCCTGC
[0049] 1. 4 巢式-PCR(HiTail-PCR)扩增基因全长
[0050] 巢式PCR是一种获得已知序列侧翼序列的有效手段，采用改进过的巢式PCR， HiTail-PCR对xynA-core的侧翼序列进行扩增。根据以上获得的约450bpDNA核心序列片 段，在核心序列内部设计三个高褪火温度的特异引物，配合通用引物LAD，AC进行PCR，经过 三轮反应后得到特异性较强的片段。
[0051] 巢式PCR扩