程图。
[0060] 图2是本发明实施例利用Mega4.1将羊草LcMT3与其他物种的MT3基因的氨基酸序 列进行聚类分析所构建的LcMT3的进化树示意图。
[0061 ]图3是本发明实施例中羊草LcMT3基因的半定量RT-PCR分析结果示意图。其中A对 应组织表达模式，B对应胁迫诱导表达模式。
[0062]图4为本发明实施例中LcMT3基因酵母表达及耐盐性鉴定试验结果示意图。其中A 为LcMT3基因与酿酒酵母RNA的Northern杂交结果示意图，图4B为正常情况下与1.4mol/L NaCl胁迫下，转LcMT3基因酵母的长势对照图。
[0063]图5为本发明实施例中LcMT3基因原核表达、纯化及耐盐性鉴定试验结果示意图。 其中A为pGEX-4T-1-LcMT3的诱导表达电泳分析结果示意图，B为pGEX-4T-1-LcMT3的蛋白纯 化电泳分析结果示意图，C为Western杂交分析结果示意图，D为耐盐性分析结果示意图。
【具体实施方式】
[0064]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0065] 图1示出了本发明提供的羊草金属硫蛋白基因 LcMT3的克隆方法的流程。为了便于 说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
[0066] 如图1所示，本发明的实施例提供的羊草金属硫蛋白基因 LcMT3的克隆方法包括以 下步骤：
[0067] 步骤一、羊草LcMT3基因的克隆及生物信息学分析；
[0068] 步骤二、半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的组织表达模式；
[0069] 步骤三、半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的胁迫诱导表达模式；
[0070] 步骤四、LcMT3基因酵母表达及耐盐性鉴定；
[0071 ] 步骤五、LcMT3基因原核表达、纯化及耐盐性鉴定。
[0072]作为本发明实施例的一优化方案，羊草LcMT3基因的克隆及生物信息学分析的具 体方法为：
[0073] 1)处理羊草种子；
[0074] 2)提取羊草叶片总RNA;
[0075] 3)3'RACE;
[0076] 4)RT_PCR克隆羊草LcMT3全长基因；
[0077] 5)生物信息学分析。
[0078]作为本发明实施例的一优化方案，处理羊草种子的方法为：
[0079] 羊草种子在蛭石中萌发，室温光照16小时，温度25°C培养，用1/2MS浇灌至四叶期， 每隔三天饶一次，用l〇〇mmol/L Na2C〇3胁迫处理24小时后，取羊草叶片至于液氮中冷冻保 存。
[0080] 作为本发明实施例的一优化方案，3'RACE的具体步骤如下：
[0081] 步骤一、在0.2ml离心管中加入lyg RNA，lyl 3'-〇)S primer A，然后加入RNase-free水补足5μ1，混合离心；72°C水浴2分钟，再冰浴2分钟，瞬时离心;加入提前混合好的5μ1 混合物，包括2μ1 5 XFirst-Strand Buffer，ΙμL DDT(20mmol/L)，ΙμL dNTP Mi χ( 1 Ommol / L)，lyl M-MLV Reverse Transcriptase;轻吸混合物使之均勾，瞬时离心；42°C水浴1.5小 时;加入Tricine-EDTA Buffer 100yl;72°C水浴7分钟，分装后-20°C冰箱中保存备用；
[0082] 步骤二、根据羊草LcMT3基因 EST设计3'RACE特异性引物GSP(5'-TCACAAGCCAAGACCACCATG-3,）：
[0083] 以 cDNA为模板，以 GSP 和 lOXUniversal Primer A Mix(5'_ CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'）为引物，50μ1 PCR反应体系：34·5μ1 PCR-Grade Water，5yl lOXAdvantage 2PCR Buffer,ΙμL dNTP Mix( lOmmol/L) , ΙμL 50XAdvantage 2Polymerase Μ?χ,?μL GSP(10ymol/L),5μ110XUniversal Primer A Mix(2ymol/L)，2·5μ 1 cDNA；
[0084] 步骤二中PCR反应条件:94 °C 2分钟；94 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 1分钟，30个循环;72 °C10分钟；
[0085] 步骤三、用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，回收目的片段，与pMD 18-T载体连 接，转化大肠感觉ToplO感受态细胞，选取阳性克隆，进行测序。
[0086] 作为本发明实施例的一优化方案，RT-PCR克隆羊草LcMT3全长基因的具体步骤为： [0087] 步骤一、将lyg RNA于70°C孵育10分钟，瞬时离心，置于冰上；4μ1 25mmol/L MgCl2,2yl Reverse Transcription 10XBuffer，2μ1 lOmmol/L dNTP Mixture,0.5μ1 Ribonuclease inhibitor,15U AMV Reverse Transcriptase,0.5yg 01igo(dT)i5Primer, 加入去离子水至20μ1;
[0088] 步骤二、根据3'RACE的测序结果与EST(⑶808743)序列拼接后得到的序列设计引 物FI(5 '-TCACAAGCCAAGACCACCATG-3 '）和R1(5 '-ACGGGTAGACGGTGATGAGAG '-3 '）：
[0089] 以 cDNA 为模板，以 F1 和 R1 为引物，50μ1 PCR 反应体系：1μ1 cDNA，lyl Fl(10ymol/ L)，lyl Rl(10ymol/L)，25yl Premix Taq?，22yl去离子水;PCR反应条件：94°C2分钟；94°C 30秒，55 °C30秒，72°C 1分钟，30个循环;72 °C 10分钟；用1 %琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，回 收目的片段，与pMD 18-T载体连接，构建重组载体pMD 18-T-LcMT3,转化大肠感觉ToplO感 受态细胞，选取阳性克隆，进行测序。
[0090] 作为本发明实施例的一优化方案，半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的组织表达 模式的具体方法为：
[0091] 将羊草培养至四叶期，取羊草叶和根至于液氮中冷冻保存；
[0092] 提取羊草叶和根总RNA，将RNA反转录成cDNA;
[0093]根据羊草Act iη基因序列（AB181991)设计引物F2 (5 ' -GGACCTTGCTGGTCGTGACC-3 '） 和R2(5 '-CCTCAGGGCACCTGAACCTTT-3 '）；
[0094] 以羊草叶和根cDNA为模板，以F1和R1 (或F2和R2)为引物，50μ1 PCR反应体系：1μ1 。0嫩，1以1?1(或卩2)(1(^111〇1/1)，1411?1(或1?2)(1(^111〇1/1)，2541?代11^叉了&9*，2241去离 子水;PCR反应条件:94°C 2分钟;94°C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 1分钟，30个循环;72 °C 10分钟； [0095]用1 %琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
[0096]作为本发明实施例的一优化方案，半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的胁迫诱导 表达模式的具体方法为：
[0097] 将羊草培养至四叶期，用400mmol/L NaCl，100mmol/L Na2C03和20%PEG6000处理 四叶期羊草，胁迫处理后0小时、6小时、12小时、24小时后，提取羊草叶片RNA;
[0098] 将RNA反转录成cDNA，以羊草cDNA为模板，以F1和R1为引物，50μ1 PCR反应体系：1μ 1 cDNA，lyl lOymol/L Fl，lyl lOymol/L Rl，25yl Premix Taq?，22yl去离子水；
[0099] PCR 反应条件：94 °C 2 分钟；94 °C 30 秒，55 °C 30 秒，72 °C 1 分钟，30 个循环；72 °C 10 分 钟；
[0100] 用1 %琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
[0101 ]作为本发明实施例的一优化方案，LcMT3基因酵母表达及耐盐性鉴定的步骤包括：
[0102] l)pYES2/CT_LcMT3 载体构建；
[0103] 2)转化酿酒酵母菌株INVScl;
[0104] 3) Northern 杂交；
[0105] 4)转LcMT3基因酵母的诱导培养及耐盐性分析。
[0106] 作为本发明实施例的一优化方案，LcMT3基因原核表达、纯化及耐盐性鉴定的步骤 包括：
[0107] l)pGEX-4T-1-LcMT3 载体构建；
[0108] 2)pGEX-4T-1-LcMT3 诱导表达；
[0109] 3)蛋白纯化；
[0110] 4)Western 杂交分析；
[0111] 5)耐盐性分析。
[0112] 作为本发明实施例的一优化方案，转LcMT3基因酵母诱导培养具体步骤如下：
[0113] 挑取对照酵母和转基因酵母单菌落，接种与加入终浓度为2%葡萄糖的SC-U液体 培养基中中，30°C振荡培养24小时；
[0114] 调整5ml的培养液0D600为0 · 3; 6000rpm离心1分钟；
[0115] 用lml诱导培养基重悬菌体，接种于50ml的诱导培养基中30°C振荡培养24小时。
[0116] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0117] -羊草LcMT3基因的克隆及生物信息学分析
[0118] 1.1材料处理
[0119] 羊草种子在蛭石中萌发，室温光照16小时，温度25°C培养。用1/2MS浇灌至四叶期， 每隔三天饶一次。用l〇〇mmol/L Na2C〇3胁迫处理24小时后，取羊草