一种羊草金属硫蛋白基因LcMT3的克隆方法
【技术领域】
[000? ]本发明属于金属硫蛋白制备领域，尤其涉及一种羊草金属硫蛋白基因 LcMT3的克 隆方法。
【背景技术】
[0002] 羊草(Leymus chinensis(Trin. )Tzvel.)又名碱草，它是欧亚大陆草原区东部草 甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。我国东北部松嫩平原及内蒙古东部为其分布中 心，在河北、山西、河南、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆等省（自治区）均有分布。
[0003] 羊草抗寒、抗旱、耐盐碱、耐土壤瘠薄，适应范围广。羊草在漫长的进化过程中积累 了丰富的抗逆基因，形成了一套完善的抗逆机制。
[0004] 金属硫蛋白（me tall othi one in, MT)是一类在动物、植物和微生物体内均广泛存 在，富含半胱氨酸(Cys)残基，能被金属诱导的低分子量金属结合蛋白。
[0005] 早在1957，Margoshes和Vallee在研究重金属锡的生物学功能时，从马肾的细胞中 首次分离除了动物MTXasterline和Barnett于1977年从大豆根中首次发现植物MT。目前已 从拟南芥、水稻、玉米、番茄、豌豆等多重植物中发现并克隆了植物MT基因。根据植物MT中 Cys残基的位置和排列方式，将植物MT分为4个亚家族，分别为MT1、MT2、MT3和MT4(Binz et al，1999)〇
[0006] ΜΤ参与了植物许多生理过程，如生长发育、胚胎发生、小孢子发生、衰老、果实发 育、成熟和抗逆等。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种羊草金属硫蛋白基因 LCMT3的克隆方法，旨在解决目 前克隆羊草金属硫蛋白基因 LcMT3的方法简陋的问题。
[0008] 本发明实施例是这样实现的，一种羊草金属硫蛋白基因 LCMT3的克隆方法，该方法 包括以下步骤：
[0009] 步骤一、羊草LcMT3基因的克隆及生物信息学分析；
[0010] 步骤二、半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的组织表达模式；
[0011]步骤三、半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的胁迫诱导表达模式；
[0012] 步骤四、LcMT3基因酵母表达及耐盐性鉴定；
[0013] 步骤五、LcMT3基因原核表达、纯化及耐盐性鉴定。
[0014] 进一步，羊草LcMT3基因的克隆及生物信息学分析的具体方法为：
[0015] 1)处理羊草种子；
[0016] 2)提取羊草叶片总RNA;
[0017] 3)3'RACE;
[0018] 4)RT-PCR克隆羊草LcMT3全长基因；
[0019] 5)生物信息学分析。
[0020] 进一步，处理羊草种子的方法为：
[0021] 羊草种子在蛭石中萌发，室温光照16小时，温度25°C培养，用1/2MS浇灌至四叶期， 每隔三天饶一次，用l〇〇mmol/L Na2C〇3胁迫处理24小时后，取羊草叶片至于液氮中冷冻保 存。
[0022] 进一步，3'RACE的具体步骤如下：
[0023] 步骤一、在0.2ml离心管中加入lyg RNA，lyl 3'-〇)S primer A，然后加入RNase-free水补足5μ1，混合离心；72°C水浴2分钟，再冰浴2分钟，瞬时离心;加入提前混合好的5μ1 混合物，包括2μ1 5 XFirst-Strand Buffer，ΙμL DDT(20mmol/L)，ΙμL dNTP Mi χ( 1 Ommol / L)，lyl M-MLV Reverse Transcriptase;轻吸混合物使之均勾，瞬时离心；42°C水浴1.5小 时;加入Tricine-EDTA Buffer 100yl;72°C水浴7分钟，分装后-20°C冰箱中保存备用；
[0024] 步骤二、根据羊草LcMT3基因 EST设计3'RACE特异性引物GSP(5'-TCACAAGCCAAGACCACCATG-3,）：
[0025] 以 cDNA为模板，以 GSP 和 lOXUniversal Primer A Mix(5'_ CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'）为引物，50μ1 PCR反应体系：34·5μ1 PCR-Grade Water，5yl lOXAdvantage 2PCR Buffer,ΙμL dNTP Mix( lOmmol/L) , ΙμL 50XAdvantage 2Polymerase Μ?χ,?μL GSP(10ymol/L),5μ110XUniversal Primer A Mix(2ymol/L),2.5μ 1 cDNA；
[0026] 步骤二中PCR反应条件:94 °C 2分钟；94 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 1分钟，30个循环;72 °C10分钟；
[0027] 步骤三、用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，回收目的片段，与pMD 18-T载体连 接，转化大肠感觉ToplO感受态细胞，选取阳性克隆，进行测序。
[0028] 进一步，RT-PCR克隆羊草LcMT3全长基因的具体步骤为：
[0029] 步骤一、将lyg RNA于70°C孵育10分钟，瞬时离心，置于冰上；4μ1 25mmol/L MgCl2,2yl Reverse Transcription 10XBuffer，2μ1 lOmmol/L dNTP Mixture,0.5μ1 Ribonuclease inhibitor,15U AMV Reverse Transcriptase,0.5yg 01igo(dT)i5Primer, 加入去离子水至20μ1;
[0030] 步骤二、根据3'RACE的测序结果与EST(⑶808743)序列拼接后得到的序列设计引 物FI(5 '-TCACAAGCCAAGACCACCATG-3 '）和R1(5 '-ACGGGTAGACGGTGATGAGAG '-3 '）：
[0031] 以 cDNA 为模板，以 F1 和 R1 为引物，50μ1 PCR 反应体系：1μ1 cDNA，lyl Fl(10ymol/ L)，lyl Rl(10ymol/L)，25yl Premix Taq?，22yl去离子水;PCR反应条件：94°C2分钟；94°C 30秒，55 °C30秒，72°C 1分钟，30个循环;72 °C 10分钟；用1 %琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，回 收目的片段，与pMD 18-T载体连接，构建重组载体pMD 18-T-LcMT3,转化大肠感觉ToplO感 受态细胞，选取阳性克隆，进行测序。
[0032]进一步，半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的组织表达模式的具体方法为：
[0033]将羊草培养四叶期，取羊草叶和根至于液氮中冷冻保存；
[0034] 提取羊草叶和根总RNA，将RNA反转录成cDNA;
[0035]根据羊草Act iη基因序列（AB181991)设计引物F2 (5 ' -GGACCTTGCTGGTCGTGACC-3 '） 和R2(5 '-CCTCAGGGCACCTGAACCTTT-3 '）；
[0036] 以羊草叶和根cDNA为模板，以F1和R1 (或F2和R2)为引物，50μ1 PCR反应体系：1μ1 。0嫩，1以1?1(或卩2)(1(^111〇1/1)，1411?1(或1?2)(1(^111〇1/1)，2541?代11^叉了&9*，2241去离 子水;PCR反应条件:94°C 2分钟;94°C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 1分钟，30个循环;72 °C 10分钟； [0037]用1 %琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
[0038]进一步，半定量RT-PCR分析羊草LcMT3基因的胁迫诱导表达模式的具体方法为：
[0039] 将羊草培养至四叶期，用400mmol/L NaCl，100mmol/L Na2C03和20%PEG6000处理 四叶期羊草，胁迫处理后0小时、6小时、12小时、24小时后，提取羊草叶片RNA;
[0040] 将RNA反转录成cDNA，以羊草cDNA为模板，以F1和R1为引物，50μ1 PCR反应体系：1μ 1 cDNA，lyl lOymol/L Fl，lyl lOymol/L Rl，25yl Premix Taq?，22yl去离子水；
[0041 ] PCR 反应条件：94 °C 2 分钟；94 °C 30 秒，55 °C 30 秒，72 °C 1 分钟，30 个循环；72 °C 10 分 钟；
[0042]用1 %琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
[0043] 进一步，LcMT3基因酵母表达及耐盐性鉴定的步骤包括：
[0044] l)pYES2/CT_LcMT3 载体构建；
[0045] 2)转化酿酒酵母菌株INVScl;
[0046] 3) Northern 杂交；
[0047] 4)转LcMT3基因酵母的诱导培养及耐盐性分析。
[0048]进一步，LcMT3基因原核表达、纯化及耐盐性鉴定的步骤包括：
[0049] l)pGEX-4T-l_LcMT3 载体构建；
[0050] 2)pGEX-4T-1-LcMT3 诱导表达；
[0051] 3)蛋白纯化；
[0052] 4)Western 杂交分析；
[0053] 5)耐盐性分析。
[0054] 进一步，转LcMT3基因酵母诱导培养具体步骤如下：
[0055] 挑取对照酵母和转基因酵母单菌落，接种与加入终浓度为2%葡萄糖的SC-U液体 培养基中中，30°C振荡培养24小时；
[0056] 调整5ml的培养液0D600为0 · 3; 6000rpm离心1分钟；
[0057]用lml诱导培养基重悬菌体，接种于50ml的诱导培养基中30°C振荡培养24小时。 [0058]本发明提供的羊草金属硫蛋白基因 LcMT3的克隆方法操作过程严谨科学，为金属 硫蛋白在科研和生产中的应用提供了重要作用。
【附图说明】
[0059] 图1是本发明实施例提供的羊草金属硫蛋白基因 LcMT3的克隆方法流