DNA文库及其引物的构建
[0033] 1.构建长度为80个核苷酸的随机ssDNA文库
[0034] 57 -ACCGACCGTGCTGGACTCA-N42-ACTATGAGCGAGCCTGGCG-37 ；
[0035] 其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N42代表长度为42bp的随机序列。
[0036] 2.引物的构建
[0037] 上游引物：5/-ACCGACCGTGCTGGACTCA-3/，如SEQIDN0 :10所示；
[0038] 下游引物l:5/-CGCCAGGCTCGCTCATAGT-3/，如SEQIDN0 :ll所示；
[0039] 下游引物2:5/-口〇17((^20)-5口&。6『18-〇6〇^66(：1^6(：11^丁八61'-3 /。
[0040] 实施例3. PTX核酸适配的筛选
[00411为了获得PTX高亲和力，高特异性结合的适配体，我们基于磁珠 SELE利记体育进行PTX 适配体筛选，其过程如图2所示。为了提高筛选的效率，从第5轮开始引入负磁珠进行反向筛 选;为了提高筛选的特异性，从第6轮开始在正向孵育的体系中加入反向靶分子(BTX-A/B、 GTX1~4、STX)共孵育。每一轮筛选，适配体与靶毒素 PTX结合的回收率如图3所示，筛选至第 10轮，ssDNA的回收率进入平台期。
[0042] (1)取lnmol的ssDNA初始文库，加入200yL结合缓冲液（20mMTris-HCl、100mM NaCl、2mM MgCh和5mM KCl、pH 7.5)，95°C水浴lOmin，冰浴猝冷5min，室温放置5min。加入 10yL PTX-磁珠，室温旋转孵育2h。孵育结束后，用结合缓冲液漂洗数次，磁性分离，去除非 特异性结合的ssDNA。在结合有DNA的PTX-磁珠复合物中加入100yL结合缓冲液，95°C水浴 15min，回收与PTX特异性结合的DNA序列。
[0043] (2)将洗脱下来的DNA作为模板，50yL的PCR反应体系如下： Hot start premix (5X) 10 pL 上游引物αΟμΜ) 2.5 μL
[0044] 下游引物（10μΜ) 2 5 uL 糢板 2.5 .uL 加入无菌水，补充体系至 50,uL
[0045] 扩增条件:94°(：，预变性11^11;94°(：，变性3〇8;60°(：，退火3〇8 ;72°(：，延伸3〇8;72°(：， 延伸2min;25个循环。
[0046] (3)单链次级文库制备:在PCR扩增的文库中加入DNA尿素加样缓冲液，充分混匀后 变复性处理，即95°C热变性10min，冰浴猝冷5min，室温放置5min;将处理好的样品加入到 12%尿素变性的聚丙烯酰氨凝胶上样孔中；接通电泳仪，200V恒定电压下进行电泳；当溴酚 蓝迀移至凝胶的下端1/3时，切断电源；在干净的平皿中加入20ml ddH20和5yL SafeView DNA染料，充分混匀后将凝胶放置其中，在水平摇床上轻轻震荡，染色15min;将聚丙烯酰胺 凝胶放置在凝胶成像系统上成像，切胶回收下端的单联文库;在装有胶的试管中加入1.5mL 的ddH20,沸水煮胶30min，离心5min，回收上清；上清进行乙醇沉淀即为下一轮筛选的次级 文库。
[0047] (4)根据上面的筛选方法重复进行下一轮筛选，至第10轮，停止筛选，将富集的文 库进行克隆和测序，获得的适配体如序列表1。
[0048] 表 1
[0049]
[0050]
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[0052] 生物膜干涉是一种免标记的分子间相互作用的分析技术。其原理是仪器发射白光 到传感器表面并收集反射光，不同频率的反射光谱受到生物传感器的光学膜层厚度的影 响，一些频率的反射光谱受到生物传感器的光学膜层厚度的影响，一些频率的反射光形成 了相长干涉(蓝色），而另一些受到了相消干涉(红色）。这些干涉光被光谱仪所检测到，并形 成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相位位移强度(nm)显示。因此，结合到传感器表面的分子 一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移直接反映出 传感器表面生物膜的厚度。
[0053] (1)首先，将生物素标记适配体用结合缓冲液溶解并稀释至5μΜ。所有适配体在使 用前均要经过95°C水浴lOmin，冰浴猝冷5min的变复性处理，以促它们重新折叠形成最佳的 空间结构。
[0054] (2)将缓冲液、适配体，一定浓度的靶分子各200yL分别加入到各反应孔中后，链霉 亲和素芯片按照设定的程序依次浸入到各反应孔，经过平衡(2min)，适配体耦合(5min)，平 衡(3min)，结合(3min)和解离(3min)五个步骤。
[0055] (3)各个芯片分别与不同浓度的靶分子PTX(50nM，100nM和200nM)和非特异性靶分 子价乂^/8(5〇11]\〇、6了乂1~4(5〇11]\〇和3了父（5〇11]\〇进行相互作用，结果如图5所示，适配体 ΑΡΤρτχ13与PTX高亲和力的结合，且结合的亲和力常数为0 · 922nM。同时适配体ΑΡΤρτχ13与其他 海洋生物毒素 BTX-A/B、GTX1~4和STX不结合，表明了 ΑΡΤρτχ13与ΡΤΧ是高亲和力、强特异性结 合。生物膜干涉技术采用的缓冲液均为结合缓冲液。每个试验都设有与缓冲液相互作用的 对照芯片，对照芯片的结合解离曲线借助Octet数据分析软件CFR Part llVersion 6.x从 样品芯片的响应值中扣除，同时采用1:1的结合模式对响应数据进行拟合如图4,得到适配 体与PTX结合的亲和常数及动力学参数，结果如表2。适配体ΑΡΤ ρτχ13、APTPTX5、APTPTX39、 aptptx14、aptptx18、aptPTX21、apt PTX3Q、aptPTX51 及 ΑΡΤΡΤΧ51 与靶分子 ΡΤΧ 结合具有较好的亲和力， 且适配体ΑΡΤρτχ13的亲和力最高为0.922ηΜ，结合速率常数为7.60Ε+05(Ι/Ms)，解离速率常数 为7.01E-04(1 /s)，是PTX典型的快结合慢解离的配体，具有巨大的实际应用的价值。
[0056] 表2
[0057]
[0058] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体，具有如下所示的通式：5'-ACCGACCGTGCTGGACTCA-N42-ACTATGAGCGAGCCTGGCG-3 7 ； 其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N42代表长度为42bp的随机序列。2. 根据权利要求1所述的与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体，其特征在于： 所述适配体选自以下序列SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :8中的任一条。3. 根据权利要求1所述的与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体在制备样品中 PTX的分离富集试剂中的应用。4. 根据权利要求1所述的与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体在制备岩沙海 葵毒素检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。5. 根据权利要求1所述的与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体在制备预防或 治疗岩沙海葵毒素中毒药物中的应用。6. 根据权利要求1所述的与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体在制备中和或 拮抗岩沙海葵毒素药物中的应用。7. 根据权利要求1所述的与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体在制备去除水 体或水产品中岩沙海葵毒素制剂中的应用。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，提供了一条与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体，具有如下所示的通式：5′-ACCGACCGTGCTGGACTCA-N42-ACTATGAGCGAGCCTGGCG-3′；其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N42代表长度为42bp的随机序列。本发明基于改良的磁珠SELE利记体育筛选得到一条与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体。该单链DNA适配体可用于样品中痕量PTX的分离富集，食品中PTX的分析检测，中和或拮抗PTX药物的制备，以及水体中PTX的去除。
【IPC分类】C07H7/06, C07H1/08, C12N15/115, G01N33/53, A61P39/02, A61K31/7088
【公开号】CN105647931
【申请号】
【发明人】高顺祥, 郑欣, 胡波, 刘德婧, 孙铭娟, 焦炳华, 王梁华
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月4日