与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一条基于改良的磁珠 SELE利记体育筛选获得的 与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体，为海产品中岩沙海葵毒素的快速检测、水 体中毒素的去除、样品中痕量毒素的分离富集，以及中和或拮抗岩沙海葵毒素毒性药物的 制备奠定了基础。
【背景技术】
[0002] 岩沙海葵毒素(palyt〇xin，PTX)是一种从海葵属软珊瑚中分离获得的海洋生物毒 素，是迄今为止已知的毒性最强烈的海洋生物毒素之一。PTX常存在于热带和亚热带的水域 中，并可通过水生食物链在鱼类或蟹类体内蓄积，人类误食这些染毒的水产品后会引起食 物中毒。中毒症状主要表现为呼吸困难、呼吸衰竭、运动失调、四肢无力、消化道广泛出血、 休克或死亡等。PTX毒性强烈，作用速度极快，对家兔的半数致死量LD50为25ng/kg，从中毒 到死亡的时间仅3~5分钟。PTX中毒没有特效药，临床目前主要是采取催吐、洗胃和活性炭 胃内毒素吸附等有限的治疗的手段。随着有害赤潮的不断加剧以及人类对海鲜产品愈发的 热衷，加大对海洋生物毒素的监控力度，加强海产品检测新技术的开发，特别是研究建立特 异性强、灵敏度尚、现场尚效快速的岩沙海癸毒素的检测方法，对于进一步完善我国食品卫 生检验标准体系，提高食品的卫生质量，保障人们生命安全，具有十分重要的重要意义。
[0003] 目前对岩沙海葵毒素检测最权威的是小鼠生物法，但这种方法特异性差、灵敏度 低，同时涉及伦理道德等问题已不主张使用。高效液相色谱法(HPLC)是毒素检测中运用最 为广泛、技术比较完善的一种检测方法，可以和多种仪器联和使用，大大提高了检测的灵敏 度和特异性。然而，该方法耗时长、样品前处理繁琐、仪器昂贵等问题而难以普及。免疫分析 法特别是酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种灵敏度高、特异性好、可实现现场快速分析的方 法，在食品安全、生物毒素检测领域已较为广泛地应用。该技术的核心是制备高灵敏性和高 特异性的抗体，但是由于抗体的制备过程复杂，储存条件苛刻，稳定性差等问题很大程度上 限制了该技术在PTX检测中的应用。
[0004] 适配体是一种功能类似于抗体的单链DNA或RNA分子，是通过体外筛选技术SELEX (指数富集性配体系统进化，Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment)从寡核酸文库中获得的核苷酸序列。与抗体相比，适配体作为一种新型的分子 识别元件具有明显的优越势，例如：不需要免疫动物可体外合成，易于标记和修饰，免疫原 性低，稳定性高，组织渗透性强等。这些特性使适配体在分析诊断领域，医药研究领域得到 广泛应用。近年来已有学者将适配体应用于海洋生物毒素检测领域，同生物传感器平台结 合，研发了许多快速、新颖的检测方法而备受关注。
[0005] 然而，关于与PTX特异性结合的分子识别探针，与PTX特异性结合的高亲和力适配 体，以及该适配体的亲和常数鉴定、优化及应用尚无相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一条与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体及其 应用。本发明的第二目的是提供上述适配体在制备样品中痕量岩沙海葵毒素的分离富集试 剂中、在制备岩沙海葵毒素检测试剂或试剂盒中、在制备预防或治疗岩沙海葵毒素中毒药 物中，以及在制备去除水体中岩沙海葵毒素制剂中等多方面的应用。
[0007] 本发明的主要技术方案是:基于改良的磁珠 SELE利记体育筛选得到一条与岩沙海葵 毒素特异性结合的高亲和力适配体。该单链DNA适配体可用于样品中痕量PTX的分离富集， 食品中PTX的分析检测，中和或拮抗PTX药物的制备，以及水体中PTX的去除。
[0008] 本发明的第一方面，是提供了一条与岩沙海葵毒素(PTX)特异性结合的高亲和力 适配体，具有如下所示的通式：
[0009] 57 -ACCGACCGTGCTGGACTCA-N42-ACTATGAGCGAGCCTGGCG-37 ；
[0010] 其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N42代表长度为42bp的随机序列。
[0011]优选的，所述单链DNA适配体选自以下序列中的任一条： [0012]APTptx13WSEQIDNO:2K*;
[0013] ΑΡΤΡΤΧ5:如SEQ ID N0:1 所示；
[0014] APTPTX39JnSEQIDN0:8K*;
[0015] APTPTXl4JnSEQIDN0:3K*;
[0016] APTPTX18JnSEQIDN0:4K*。
[0017] 本发明的第二方面，是提供了上述适配体在制备样品中PTX的分离富集试剂中的 应用。
[0018] 本发明还提供了上述适配体在制备岩沙海葵毒素检测试剂、试剂盒或传感器中的 应用。所述的试剂、试剂盒或传感器可用于快速检测水体或水产品中的PTX。
[0019] 本发明还提供了上述适配体在制备预防或治疗岩沙海葵毒素中毒药物中的应用。 所述的药物也为中和岩沙海葵毒素毒性的药物、或为岩沙海葵毒素拮抗剂等。所述的药物 可以缓解、治愈岩沙海葵毒素中毒导致的呼吸困难、呼吸衰竭、惊厥、痉挛、运动失调、嗜睡、 四肢无力、虚脱、呕吐、消化道广泛出血、休克、死亡等症状。
[0020] 本发明还提供了上述适配体在制备去除水体或水产品中岩沙海葵毒素制剂中的 应用。所述的制剂可以完全去除水体或水产品中的岩沙海葵毒素，或者降低水体或水产品 中岩沙海葵毒素的含量使其达到联合国卫生组织和联合国粮农组织规定及推荐的标准以 下。
[0021 ]本发明鉴于PTX稳定性高，水溶性好的结构特点，设计了基于改良的磁珠 SELEX技 术，筛选得到与PTX高亲和力、强特异性结合的单链DNA适配体。这些适配体作为与PTX特异 性结合的分子识别探针，具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、免疫原性低、成本低、易制备、 修饰和标记等优势。可用于样品中痕量PTX的分离富集，食品中PTX的分析检测，中和岩沙海 葵毒素药物的制备，拮抗岩沙海葵毒素药物的制备，以及水体中毒素的去除。
[0022]因此，本发明的适配体面向实际应用具有巨大的潜力。
【附图说明】
[0023]图1岩沙海葵毒素固定至羧基修饰的磁珠表面的示意图。
[0024]图2是基于磁珠 SELE利记体育PTX适配体筛选的示意图。
[0025] 图3是每一轮筛选中适配体与靶分子PTX的结合率图。
[0026] 图4基于生物膜干涉技术测定适配体亲和力的拟合曲线图。
[0027]图5是适配体ΑΡΤρτχ13亲和力和特异性鉴定图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0029]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆：实验室指南（New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的 条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非 另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方 法与材料仅作示范之用。
[0030] 实施例1.岩沙海葵毒素在羧基修饰的磁珠表面的固定
[0031] PTX与磁珠的偶联示意图如图1所示，具体过程为：（a)配制25mM的MES溶液，调节pH 至6.0，取400yL、30mg/mL羧基修饰的磁珠用pH 6.0的MES溶液清洗3-5遍。分别加入500yL、 50mg/mL新鲜制备的EDC和NHS溶液于上述漂洗过的磁珠中，充分混匀，室温低速旋转孵育 30min。孵育结束后，将装有磁珠的离心管放置于强磁铁上吸附5min，移去上清液，得到活化 的磁珠。（b)取200yL活化的磁珠，加入500yL、20yg/mL的PTX溶液，室温低速旋转孵育60min。 孵育结束后，未结合到磁珠上的PTX用MES溶液冲洗，磁性分离回收上清液。在PTX-磁珠复合 物中加入200yL、0.5M乙醇胺封闭磁珠表面未耦合的羧基，以提高筛选的效率。封闭结束后， 用筛选缓冲液(2〇11111^8-!1(：1、10〇1111恥(：1、211111%(：12和511111((：14!17.5)漂洗数次后，加 入200yL的筛选缓冲液，4 °C保存，作为正向筛选的磁珠。上清液中未固化至磁珠表面的PTX 用紫外分光光度计测含量，计算出耦合效率为91.7%。（c)在剩余的200yL活化的磁珠中入 200yL、0.5M乙醇胺溶液，室温低速旋转孵育60min。孵育结束后，用筛选缓冲液漂洗数次，加 入200yL的筛选缓冲液，4 °C保存，用作反向筛选。
[0032]实施例2.随机ss