q ID No.3:5'-TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3'；
[0047] Seq ID No.4:5-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3,。
[0048] 回收上述引物在PI和P2中扩增的谱带并测序，在抗病材料PI中的核酸序列如SEQ ID No. 1所示，在感病材料P2中的核酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0049] 利用上述InDel标记引物(Ty-3-InDel)在抗性亲本P1和感病亲本P2构建的F2群体 中进行进一步检测，结果显示（图3)在48个单株中，标记Ty-3-InDel处基因型为纯合阳性 (只有510bp的特异谱带）的单株8株，编号分别是7、17、21、28、30、34、36和40号单株;该标记 处基因型为杂合阳性（同时存在510bp和260bp的特异谱带）的单株26株，编号分别为1、3、4、 6、8、9、11、12、13、14、16、18、19、20、22、23、25、26、31、32、38、39、41、44、46 和 47 号单株；该标 记处基因型为纯合阴性（只有260bp的特异谱带）的单株14株，编号分别为2、5、10、15、24、 27、29、33、35、37、42、43、45和48号单株;检测为阳性的单株，接种鉴定结果均为抗病，检测 为阴性的单株，接种鉴定结果均为感病。
[0050] 实施例2利用InDel标记引物对Ty-3基因进行分子标记辅助选择
[00511利用实施例1中所开发的基于Ty-3的InDel标记引物(Ty-3-InDel)对课题组准备 转育Ty-3基因的代群体材料48株(高可溶性固形物的感病亲本P31为母本，含Ty-3基因 的自交系P55为父本，其Fi代与P31进行回交获得B&)进行分子标记辅助选择。结果表明（图 4):在48个单株中，标记Ty-3-InDel检测到基因型为杂合阳性（同时存在510bp和260bp的特 异谱带)单株 19 株，编号分别是1、2、3、5、9、13、14、16、18、21、29、30、33、37、39、40、42、43和 47号单株;标记Ty-3-InDel检测到基因型为阴性(仅存在260bp的特异谱带)单株29株，编号 分别是4、6、7、8、10、11、12、15、17、19、20、22、23、24、25、26、27、28、31、32、34、35、36、38、41、 44、45、46和48号单株;检测为阳性的单株，接种鉴定结果均为抗病，检测为阴性的单株，接 种鉴定结果均为感病;选择阳性单株进一步与P31回交、分子标记辅助选择，可提高Ty-3基 因的转育效率。也证明了本实验发明的分子标记与抗性基因 Ty-3共分离。
[0052]上述实施方案为本发明最佳的实施方案，但本发明的实施方案并不受上述实施方 案的限制，其他的任何不违背本发明原理的条件下，可以通过改变参数的形式所产生的实 施例，都包含于本发明的保护范围之内。 序列表 <110>青岛农业大学 <120>基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 7V-3的InDel分子标记 <130>基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 7V-3的InDel分子标记 <3bO> 10 <170> Patent In version 3.3 <210> 1 <211> 510 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1
[0053] tgcaggaaca gaatgataga aaaacatatc tgtcttttta agtgttttga ttctctggta 60 ttggttattc tgtatgcatc tttataatcc cttgatgtta tttttgcagt atcttttaat 120 actctaggta ggcatagtat ttgagatagc ccaaaagatt aaaaggtagg tcaataaatg 180 gaaggaggag attgttgctt aatgacctat attccaggtc aatctagtta gagccaaaat 240 gcacatctaa tgaaattgtt aatttgcatg gctttattag tgaaaacatg taccacaagt 30Q aatacttaat tattcaaaca tgggtttctg tctctctctc tctctctctc tctctctatt 36D ttcttcttct ggttcccact tgctaattgg tagagacaac acacataagt ttcacctgtg 420 gtgaaggtag tgcggaaaga ttatctgctt attctttaat ctattttgtg gagtaccctt 480 agnctaagta tgtrtr:aggt gatgctgage 510 <210> 2 <211〉 260 <212> DNA <21B> Artificial Sequence <400> 2 tgcaggaaca gaatgataga aaaacatatG tgtcttttta agtgttttga ttctctggta 60 ttggttattc tgtatgcatc tttataatcc cttgatgtta tttttgcagt atcttttaat 120 actctaggta ggcatagtat ttgagacaac acacataagt ttcacctgtg gtgaaggtag 180 tgcggaaaga ttatctgctt attctttaat ctattttgtg gagtaccctt agcctaagta 240 tgtctcaggt gatgctgagc 260 <210> 3 <2ll> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tgcaggaaca gaatgataga aaa 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gcteagcate acctgagaca 20 <210> 5
[0054] <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ggc aaaaacc accgtgtaGt 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 gclagaagca acgtllgUg g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 caacggaggg agcatateat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 tetGCGaggg ctetGtgtaa 20 <210> 9
[0055] <211> 20 <21Z> DNA <2 丄 3> Artificial Sequence <4〇〇> 9 atcccctcaa attgctgatg 20 <210> 10 <2ll> 20 <2i2> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 atgatatgct ccciccgug 20
【主权项】
1. 一种基于番前黄化曲叶病毒病抗病基因 Ty-3的InDel分子标记，该分子标记的核苷 酸序列如SEQ ID No.l所示。2. 扩增权利要求1所述的分子标记的引物。3. 如权利要求2所述的引物，该引物序列如下： 正向引物序列:5 ' -TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3 ' ； 反向引物序列:5 '-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3 '。4. 使用权利要求1所述分子标记的检测方法，其特征在于， 该方法以抗感番茄黄化曲叶病毒病的番茄基因组DNA为模板经PCR扩增，得到能同时鉴 定父本、母本及其杂合体的基因型的特异谱带，该特异谱带为携带抗性基因的植株谱带和 不携带抗性基因的植株谱带，所述携带抗性基因的植株谱带为权利要求1所述的分子标记。5. 如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系（20yL)如下:包括正、 反向引物各〇·8μΜ，1·2πιΜ dNTPs，2.5mMMgCl2,2yl 10Xbuffer，0.5units Taq聚合酶，DNA 模板30-50ng，ddH2〇 补至 20yL。6. 如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序均为：94°C预变性 5!1^11;94°(：变性3〇8,60°(：退火458,72°(：延伸458,35个循环 ；72°(：延伸1〇1^11;保存温度4°(：。7. 如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述不携带抗性基因 Ty-3的植株谱带的 核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。8. 权利要求1所述分子标记在番茄黄化曲叶病毒抗性基因 Ty-3检测或标记辅助育种中 的应用。9. 权利要求3所述的引物在番茄黄化曲叶病毒抗性基因 Ty-3检测或标记辅助育种中的 应用。10. 权利要求4-6任意一项所述鉴定方法在番茄黄化曲叶病毒抗性基因 Ty-3检测或标 记辅助育种中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-3的InDel标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。本发明还涉及一种扩增基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的InDel标记的引物对，该引物对序列如下：正向引物序列：5’-TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3’；反向引物序列：5’-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3’。本发明的分子标记完全基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3。本发明开发出基于黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的InDel标记，该标记完全基于抗性基因Ty-3，与Ty-3基因完全连锁，为共显性分子标记。将该标记用于黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的分子标记辅助选择，可大幅提高选择的准确性，缩短育种年限，从而加速育种进程。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105647920
【申请号】
【发明人】王富, 王辉, 李文丽, 董盼盼
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年4月7日