基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的InDel分子标记的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术工程领域，特别涉及一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗性 基因 Ty-3的InDel分子标记及扩增该分子标记的引物、利用分子标记的检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 番前(Solanum lycopersicum L.)属于前科(Solanaceae)，为一年生草本前科植 物。番茄起源于南美西部地区，是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜作物之一，深受广大消费 者的喜爱。随着番茄栽培面积的逐年扩大，栽培方式的多样化，番茄病虫害问题日趋严重， 近年来，番茄黄化曲叶病毒病在世界各地保护地番茄种植上普遍发生，给番茄生产带来巨 大经济损失。因此培育抗黄化曲叶病毒新品种对番茄的生产意义重大。
[0003] 番前抗TYLCV植株材料先后在Solanum pimpinellifolium、Solanum peruvianum、 Solanum chilense、Solanum habrochaite、Solanum cheesmaniae等野生材料中发现。抗源 材料不同，其抗性遗传规律也不同。目前已发现的抗性基因主要有Ty-l、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、 Ty-4、Ty_5,其中Ty-l、Ty-2、Ty_3作为番茄抗TYLCV的主效抗性基因在生产中得以应用 (Liedl，et al.，2013)。国内番茄抗黄化曲叶病毒病育种起步较晚，与国外先进国家有较大 的差距。由于番茄黄化曲叶病毒变异较大，这使番茄抗番茄黄化曲叶病常规育种进展很慢。
[0004] 与传统的遗传育种相比，分子标记有很多优点，尤其是以PCR为基础的DNA分子标 记技术大大加快了育种的进程和效率。目前，已有诸如REX_l(de Castro et al.，2007)、 TG0302(Garcia et al.,2007)、P6-25(Ji ve ark.,2008)和UF_TY3-P23(Verlaan,et al·， 2013)等多个与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因紧密的连锁标记被陆续开发出来，并逐步在 育种实践中加以应用。但这些标记均与抗病基因间存在一定的遗传距离，故筛选时会出现 一定比例的假阳性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗病基因 Ty-3的InDel标 记。
[0006] 本发明的另一目的在于提供该分子标记在番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 Ty-3检 测以及标记辅助育种中的应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明提供了一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗病基因 Ty-3 的InDel标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0008] 本发明还提供了一种扩增基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 Ty-3的InDel标记的 弓丨物对，该引物对序列如下：
[0009] 正向引物序列：5' -TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3' ；
[0010] 反向引物序列:5'-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3'。
[0011] 本发明还提供了一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 Ty-3的InDel标记的检测 方法，该方法以抗感番茄黄化卷叶病毒的番茄基因组DNA为模板经PCR扩增，得到能同时鉴 定父本、母本及其杂合体基因型的特异谱带，该特异谱带为携带抗性基因的植株谱带和不 携带抗性基因的植株谱带，所述携带抗性基因 Ty-3的植株谱带为核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的分子标记。
[0012]所述不携带抗性基因 Ty-3的植株谱带的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0013] 上述方法中，PCR反应体系（20yL)为：包括正、反向引物各0.8μΜ，1.2πιΜ dNTPs， 2 · 5mMMgCl2，2yL 10 X buffer，0 · 5units Taq聚合酶，DNA模板30-50ng，ddH20补至20yL。
[0014] 上述方法中，PCR扩增的程序均为:94°C预变性5min;94°C变性30s，60°C退火45s， 72°(：延伸458,35个循环;72°(：延伸1〇1^11 ;保存温度4°(：。
[0015] 本发明还提供了上述分子标记和检测方法在番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 Ty-3 检测或标记辅助育种中的应用。
[0016] 有益效果：
[0017] 1)本发明的分子标记完全基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 Ty-3。该标记引物的 特异性强、稳定性高，并且标记的筛选方法操作简便快捷，对检测设备和引物模板质量要求 不高，具有试验试剂用量少，速度快，成本低，适合大批次、高通量、自动化的优点。非常适合 现代农业分子育种的实现。
[0018] 2)本发明的番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 Ty-3特异分子标记引物应用于育种工 作中，将大大降低番茄黄化曲叶病毒病流行对番茄生产造成的经济损失，同时减少农药使 用量，有益于降低生产成本，具有很大的应用潜力和较高的经济价值。
[0019] 3)本发明开发出基于黄化曲叶病毒病抗性基因 Ty-3的InDel标记，该标记完全基 于抗性基因 Ty-3,与Ty-3基因完全连锁，为共显性分子标记。将该标记用于黄化曲叶病毒病 抗性基因 Ty-3的分子标记辅助选择，可大幅提高选择的准确性，缩短育种年限，从而加速育 种进程。
【附图说明】
[0020] 本发明有如下附图：
[0021] 图1为InDel标记(Ty-3-InDel)在感病材料和抗病材料中的部分DNA序列
[0022] (P2与P1间存在250bp的缺失）；
[0023] 图2为InDel标记Ty-3-InDel在亲本间及F!中的PCR产物检测结果（1: 100bp ladder;2_3:感病亲本P2;4_5:抗病亲本PI ;6_7:Fi单株）；
[0024] 图3为InDel标记Ty-3-InDel在F2群体中的检测
[0025] (M:D2000; 1-48 :F2 代单株）；
[0026] 图4为InDe 1标记Ty-3-InDe 1在回交群体中的应用
[0027] (M:D2000; 1-48 :BCi 代单株）。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范 围。
[0029]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0030] 实施例1基于Ty-3基因的InDel标记的开发及验证
[0031] 1.供试材料
[0032]本试验所用的抗病自交系P1和感病自交系P2经已知分子标记P6-25检测证实，P1 为抗病纯合体(Ty-3/Ty-3)，而P2为感病纯合体(ty-S/tylhPl为母本，P2为父本配制杂交 组合，得到F1后，再自交得到F2分离群体。
[0033] 2.接种鉴定
[0034]抗性鉴定采用烟粉虱接种鉴定法，具体参照杨晓慧(2012)的方法。于幼苗2-3片真 叶期，将其放置于放有带毒烟粉虱的生长室内，两周后杀死带毒的烟粉虱，之后将苗子移栽 到日光温室或大田中，观察病情结果。
[0035] 3. InDel分子标记的开发及验证
[0036] A、InDel标记的开发
[0037] Verlaan等（2013)报道Ty-3基因即为Solyc06g051190。登陆SGN(Sol Genomics Network)网站( http://solgenomics.net/)，获得Solyc06g051190序列，利用在线引物设计 软件Pr imer 3plus，分段设计引物(表1)。本试验中所用到的番茄材料P1和P2的基因组DNA 从2-3周幼苗的叶片中用CTAB法提取(Fulton et al. ,1995)。根据设计的引物，对样品P2和 P1的DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系:扩增反应的总体积为50yL，5. OyL模板DNA，5. OyL 10 X PCR Buffer(含Mg2+)，4.0yL High Pure dNTPs(2.5mM)，10yM的上下游引物各 1.0yL，0.3yL EasyTaq DNA Polymerase (5U · μL-1)，无菌纯水33 · iyLePCR反应程序为：94°C预变性5min; 94°C变性lmin， 55°C退火45s，72°c延伸lmin，35个循环；72°C延伸lOmin;保存温度4°C。取 PCR扩增产物约10yL，在1%琼脂糖凝胶电泳上检测PCR扩增结果，Bio-RAD自动凝胶成像系 统观察照相，记录电泳结果。琼脂糖凝胶电泳检测成功后，PCR产物使用胶回收试剂盒 (ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit)回收并进行TA克隆测序。
[0038] 对P1和P2两份材料PCR产物测序并进行核酸序列分析，发现感病材料P2中出现长 度为250bp核酸片段的缺失，针对该段序列缺失，利用在线引物设计软件Primer 3plus设计 该InDel标记的引物(Ty-3-InDel)序列（图1，表2) Jy-3-InDel在理论上感病材料中可扩增 出260bp特异性片段，而抗病材料可扩增出510bp特异性片段。
[0039]表1以基因 Solyc06g051190为模板设计的引物
[0040]
[0041 ] 表2基于Ty-3的InDel标记的引物
[0042]
[0043] B、InDel标记的扩增及检测
[0044]本试验中所用到的番茄材料P1、P2及其Fi的基因组DNA从2-3周幼苗的叶片中用 CTAB 法提取(Fulton et al. ,1995) <JnDel 标记的 PCR 反应体系（20yL):DNA 模板 HOng.yL-1) 5.0yL，10XPCR Buffer(含Mg2+)2.0yL，High Pure dNTPs(2.5mM)2.0yL，上下游引物（ΙΟμΜ) 各 1.0yL，EasyTaq DNA Polymerase(5U · yrqO.SyUdd^OSJyl^PCR 反应程序：94°C 预变 5min;94°C 变性 45s，58°C 退火 45s，72°C 延伸 458,35个循环；72°(：延伸1〇1^11;保存温度4°(：。 PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行分离鉴定，然后在凝胶成像仪上观察照相，并记录电 泳结果。
[0045] InDel标记引物(Ty-3-InDel)在抗病亲本P1、感病亲本P2进行PCR扩增，证实其在 双亲间能够扩增出多态性(在P1中扩增出510bp的特异条带，在P2中扩增出260bp的特异条 带，在Fi中同时扩增出510bp和260bp两条特异条带），该标记可靠性高、稳定性最好、且不需 要酶切。该引物的扩增结果如图2所示，具体引物序列如下：
[0046] Se