烟4U的上限， 评吸合计值较低。表1:
注:表中香气质包括细腻度、圆润性和绵延感;刺激性包括对口腔、鼻腔、喉部的刺激 性;杂气包括枯焦、粉杂掘、生青气和其他杂气。
[0048] ②山东临沂B3F烟样评吸结果(见表2) 从表2评吸结果来看，酸性木聚糖酶对山东临沂B3F烟样品质改善提高效果不明显。除 对劲头无效外，对各项均有一定的均衡改善略有增值，仍以lmL用量发酵7d评吸值增加到最 大值，合计值仅比对照增加1 %。2mL、3mL用量下偏离适宜用酶范围出现了合计值下降现象。 20d与7d的各项分值相同，而40d时主要表现为香气质改善，得分从小于对照9.5分的9分增 加为与lmL酶用量下相同的大于对照值10分，合计值成为正增长值。山东烟草异于云南烟 草，这种提高较小，较为均衡的情况值得深入研究，明了这种问题，将使酸性木聚糖酶有更 多应用对象。表2:
[0049] (七)浓缩酸性木聚糖酶原液制剂作为第二次润叶用水取样分析检测及结果 为了检验本发明酸性木聚糖酶制剂作为第二次润叶用水的效果，以云南大理红大 VC03C和云南大理红大VC03B两种烟样为处理对象，在实验室条件下模拟烟叶片烟复烤醇化 过程，考察浓缩酶制剂对醇化（自然发酵)前期的影响。将3500U/mL的浓缩酸性木聚糖酶制 剂用自来水稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，酸性木聚糖酶最佳酶活力为 14U/mL。对照用相同量的自来水作为润叶水。打叶、复烤后，各个包装500g烟叶，处理平行重 复不少于3次，在相对湿度65%的室温下自然醇化60天，分别制成烟丝混匀，取样分析。
[0050] ①处理烟叶常规分析 根据检测，云南大理红大VC03C处理烟样与对照相比：总糖下降7.5%、钾离子上0.42%、 还原糖下降5.4%、总植物碱下降4.1%、氯离子上升11. .25%、总氮下降1.75%; 云南大理红大VC03B处理烟样与对照相比：总糖下降4.7%、钾离子下降0.88%、还原糖下 降2.4%、总植物碱下降0.33%、氯离子上升6.85%、总氮下降1.04%。
[0051] 两种处理烟样对比很明显，出现VC03C烟样各检项升降幅度大于VC03B烟样。特别 是钾离子在VC03B烟样中反而较大幅度的下降。说明：酸性木聚糖酶对VC03B烟样的钾离子 影响还起反作用。
[0052]②致香成分 根据样品分析，云南大理红大VC03C处理样的致香成分总量比对照样增加了22.7%;而 云南大理红大VC03B处理样也比对照样有所增加，说明此处理方法对于增加致香成分总量 是有效的。按类别其中VC03C烟样的醇类物质比对照样增加了 13%，VC03B烟样同样有所增 加;VC03C烟样中酚类物质量高于对照。相反，VC03B烟样则是有所下降;醛和酮类物质VC03C 烟样中都有增加(其中酮类增加了 16%)，在VC03B烟样中仅有略增加;酸类物质VC03C烟样中 增加了 147%，VC03B烟样中也比对照样增加了近10%;酯类化合物VC03C烟样增加了 15%， VC03B烟样则也有所增加。
[0053] 致香成分在VC03C烟样中效果明显，致香成分比对照样增加了22.7%，在VC03B烟样 中除酚类物质外的都有所增加。总体上来说酸性木聚糖酶对烟草致香成分的形成累积增 加，是积极有效的。至于VC03B烟样增加较少的之一原因，可能酶用量偏离适宜范围的原因。 2%〇的用酶量相当于用了最佳的两倍，相当于每lg烟样受到7U酸性木聚糖酶的作用。在 "(三)浓缩酸性木聚糖酶原液制剂的酶活力评吸检测及效果"中，评吸结果中也是在香韵香 气量和口感干净度上得分值低于最佳用酶量的处理效果。
【主权项】
1. 以市售的酸性木聚糖酶制备烟草加工的辅助酶制剂，其特征是：该制剂酸性木聚糖 酶的酶活力在50°C和PH4.5下为3000~4000U/mL。2. 根据权利要求1所述的酶制剂，其特征是：该制剂酸性木聚糖酶的最佳酶活力为 3500U/mL〇3. 制备如权利要求1~2之一种所述的以酸性木聚糖酶作为烟草加工辅助添加的酶制 剂的方法，包括以下步骤： (1) 用pH4.5缓冲液溶解蛋白酶活性抑制剂PMSF，PMSF在缓冲液中的浓度为0.0 lmol/L， 再按缓冲液与水的体积比1:4稀释缓冲液;将市售的酸性木聚糖酶固体物酶源与稀释缓冲 液该两者按重量体积比1 g: 10~20mL混匀得混合液，加入NaCl搅拌溶解，混合液与NaCl的 重量体积比为〇. 75g /L;过滤，收集滤液作为待精制处理的粗酶液，静置； 上述缓冲液为Britton-Robinsion缓冲液； 上述在市售的酸性木聚糖酶固体物酶源中加入PH4.5的稀释缓冲液的量与酶源的原始 酶活力呈正相关； (2) 在步骤（1)静置1 h的粗酶液中加入(NH4) 2S〇4，（順4) 2S〇4浓度为25 %，缓慢搅拌溶解， 静置2h;继续加入(NH4)2S04浓度至80%，静置过夜，离心得到第一次沉淀;所得上清液则补加 10%的(NH 4)2S04静置过夜后，再离心得第二次沉淀，合并以上两次沉淀； 所述(NH4)2S〇4浓度为重量体积比； (3) 配制浓度为0.1%的EDTA溶液，该溶液与沉淀的体积比为1:2; 将步骤(2)收集的沉淀与pH4.5的稀释缓冲液按体积比2:1混匀后加入以上EDTA溶液， 静置，离心，得到去除金属离子的酶上清液； (4) 往酶上清液加入浓度为0.01%的蔗糖低聚物，酶上清液与蔗糖低聚物的体积比为 100:1，作为初制品，-8 °C冷冻干燥浓缩至初制品的1/8~1/10倍，得酶活力为3000~4000U/ mL浓缩的酸性木聚糖酶制剂，其中，浓缩的酸性木聚糖酶制剂的最佳酶活力为3500U/mL; 所述蔗糖低聚物浓度为重量体积比。4. 根据权利要求3所述的酶制剂制备方法，其特征是:所述步骤（1)ρΗ4.5的稀释缓冲液 中加有Ca(N03) 2、MgS〇4、ZnS〇4和 FeS〇4,其中，Ca(N03)2、MgS〇4、ZnS〇4和 FeS〇4分别与缓冲液 的重量体积比为〇.3g /100mL，以恢复酶制剂的酸性木聚糖酶酶活力，及在50°C下所测定的 酶活力。5. 根据权利要求3或4所述的酶制剂制备方法，其特征是:步骤(1)酶源的原始酶活力5， 〇〇〇U/g，酸性木聚糖酶固体物与pH4.5的稀释缓冲液该两者按重量体积比1 g: 10mL:酶源的 原始酶活力10，〇〇〇U/g，酸性木聚糖酶固体物与pH4.5的稀释缓冲液该两者按重量体积比1 g：20mL〇6. 根据权利要求3或4所述的酶制剂制备方法，其特征是:步骤(4)以浓度为0.01%的β-环糊精替代蔗糖低聚物，酶上清液与环糊精的体积比为100:1，作为初制品，_8°C冷冻干 燥浓缩至初制品的1 /8~1 /10倍，得酶活力为3000~4000U/mL浓缩的酸性木聚糖酶制剂。7. 根据权利要求5所述的酶制剂制备方法，其特征是:步骤(4)以浓度为0.01%的β-环糊 精替代蔗糖低聚物，酶上清液与β-环糊精的体积比为100:1，作为初制品，_8°C冷冻干燥浓 缩至初制品的1 /8~1 /10倍，得酶活力为3000~4000U/mL浓缩的酸性木聚糖酶制剂。8. 应用如权利要求1~2所述之一种的酸性木聚糖酶作为烟草加工辅助添加的酶制剂 的方法，其特征是:该原液制剂以戊聚糖含量在11%~19%的烟草作为适宜的处理对象。9. 根据权利要求8所述的酶制剂的应用方法，其特征是:将酶活力为3000~4000U/mL的 浓缩的酸性木聚糖酶制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其使用的酶活力 范围为12~16U/mL。10. 根据权利要求8所述的酶制剂的应用方法，其特征是:将酶活力为3500U/mL的浓缩 的酸性木聚糖酶制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其最佳酸性木聚糖酶 酶活力为14 U/mL。
【专利摘要】以市售的酸性木聚糖酶制备烟草加工的辅助酶制剂及应用，属于烟草复烤前添加的可提高烟草品级的酶制剂。本发明酶制剂的酶活力在50℃和pH4.5下为3000？U/mL～4000U/mL，优选3500U/mL，该酶活力是在稀释缓冲液中加有Ca(NO3)2、MgSO4、ZnSO4和？FeSO4恢复酶活性后测定的。制备：以市售的酸性木聚糖酶为制备酶源，用加有PMSF的Britton-Robinsion缓冲液并加入NaCl搅拌溶解，过滤，收集滤液，再用？(NH4)2SO4浓度分次沉淀、离心，收集沉淀，并进一步去除金属离子和冰冻浓缩等。应用：以聚戊糖含量在11%～19%的烟草作为适宜的处理对象，稀释制剂250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水。
【IPC分类】A24B15/30, C12N9/42, A24B15/20
【公开号】CN105647889
【申请号】
【发明人】韩伟, 黄文荣, 刘士清, 张无敌, 尹芳, 陈应昆, 何宝玉, 赵春雷, 雷宇, 王金浩, 王应中, 韩梦璇, 赵刚
【申请人】云南万芳生物技术有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月25日