5g /L加入 0.825g NaCl,搅拌充分溶解,过滤,收集滤液,静置lh待后续处理。
[0025]所述市售的酸性木聚糖酶固体物的酶源的原始酶活力以此参考,而与pH4.5的稀 释的Britton-Robinsion缓冲液加入量呈正相关。
[0026] 所述pH4.5的稀释的Britton-Robinson缓冲液是与水按二者体积比为1:4配制的 溶液,并在pH测量计下,用2mol/L NaOH溶液调到所需pH值4· 5。
[0027] 进一步,上述口!14.5的稀释的131';[1:1:011-1?013;[118;[011缓冲液中均溶解有?]\07蛋白酶活 性抑制剂,PMSF的浓度为0.01m 〇l/L,其用途在于避免蛋白酶活性破坏酸性木聚糖酶。
[0028] (2)两种待后续处理的酶静置液以下步骤相同,具体为: 取步骤(1)静置液1L,加入(NH4)2S〇4至上清液的(NH4)2S〇4浓度为250g/L,搅拌溶解;静 置2h,继续加入(NH4)2S〇4,至(NH4)2S〇4浓度为800g/L,搅拌溶解;静置过渡,4°C 15000r/ min离心30min,得第一次沉淀。仅取上清液,补加浓度100 g/L(NH4)2S〇4继续静置过夜,再4 °C 15000r/min离心30min,收集第二次沉淀和第一次沉淀合并。
[0029] (3)预先配制浓度为0.1% EDTA溶液,该0.1% EDTA溶液体积为步骤(1)起始用缓冲 溶液l〇〇〇mL体积的一半500mL。将步骤(2)所收集的沉淀与pH4.5的稀释的Britton-Robinsion缓冲液按体积500mL混匀后加入以上0.1% EDTA溶液,即步骤(2)所收集的沉淀用 0.1%EDTA溶液和pH4.5的稀释的Britton-Robinsion缓冲液恢复为1000mL的原始体积。静 置,离心,得到去除金属离子的酶上清液。
[0030] 上述EDTA为乙二胺四乙酸二钠,可络合沉淀除去在酶液中的二价金属离子,避免 影响酸性木聚糖酶稳定性。
[0031] (4)往步骤(3)酶上清液中加入浓度(W/V)为0.01%的蔗糖低聚物,酶上清液与蔗糖 低聚物体积比为100:1,得初制品,该初制品经-8°c冷冻干燥浓缩至1/8~1/10倍,得酶活力 为3000~4000U/mL浓缩的酸性木聚糖酶制剂。
[0032]检测各批次浓缩的酸性木聚糖酶制剂的酶活力,然后多批以酶活力高与低的相互 兑配,使制备产品的酸性木聚糖酶的酶活力为3500U/mL。
[0033]上述蔗糖低聚物为制糖工业应用的蔗糖酯聚合物,作用是稳定和保护浓缩液中的 酸性木聚糖酶,以延长商品货架期。
[0034] 实施例2 针对以上实施例1的步骤(1),在pH4.5的稀释的Bri tton-Robinsion缓冲液中分别加入 Ca(N03)2、MgS〇4、ZnS〇4和 FeS〇4,其中,Ca(N03)2、MgS〇4、ZnS〇4和 FeS〇4分别与缓冲液的重量 体积比为〇.3g /100mL,以恢复酸性木聚糖酶的酶活力,并在50°C下测定结果。
[0035] 实施例3 在酶制剂制备方法的步骤(4)中,用浓度为0.01%的β-环糊精替代蔗糖低聚物,酶上清 液与β-环糊精的体积比为100:1,作为初制品,-8°C冷冻干燥浓缩至初制品的1/8~1/10倍, 得酶活力为3000~4000U/mL浓缩的酸性木聚糖酶制剂。
[0036] β-环糊精可替代蔗糖低聚物,效果更好,但价格比蔗糖低聚物高。
[0037](二)按《沼气发酵实验教程》检测浓缩的酸性木聚糖酶原液制剂的酶活力 酶活力(性)是指在特定体系下测到的体现反应速度的酶表征结果。温度和pH值是酶活 力测定及酶活力定义中的两项基本要素,与本发明密切的酸性木聚糖酶更为明显的是pH 值。
[0038] 以上《沼气发酵实验教程》(刘士清,张无敌,尹芳,等,沼气发酵实验教程,北京:化 学工业出版社,2013,pl35)为本发明人编撰。 酸性木聚糖酶酶活力单位(U)定义:在50°C和pH4.5下1%木聚糖底物溶液中反应10min, 每min产生Ιμπιο?/L木糖所需的酶量定义为1U。
[0039] 所述的酸性木聚糖酶原液制剂的酶活力测定,将需检样品稀释成适宜酶测定的稀 释倍数,是指用pH4.5的稀释的Bri tton-Robinsion缓冲液来对酶原液制剂进行稀释,稀释 倍数以最终的〇D54Qr?值读数在0.2~0.4范围而确定。所用的缓冲液中每100mL中补加有Ca (N03)2、MgS〇4、ZnS〇4和FeS〇4各0·3g作为基本的酶稳定与激活剂,恢复或增强酶活力。
[0040] 在25mL刻度试管中加入1.8mL用Britton-Robinson缓冲液配制的木聚糖溶液 (0.01 g/mL,缓冲液pH4.5),在50 °C反应温度下水浴预热5min,准确计时加入适当稀释度的 酶液V=0.2mL(200yL),沸水浴保温准确反应10min。加入DNS试剂以测定还原糖方法测OD54〇 nm 值。以木糖标准溶液,计算酶活力单位(μπιο 1 /mL或μπιο 1 /g )。
[0041] 酶活力 E=(nXW)/(M*XVX10) 式中:E-样品的酶活力,U/g,或U/mL;W-由样品平均0D值通过回归方程得到的对应木 糖量,yg; η -样品的稀释倍数;V-参与反应的酶液量,mL; 10 -反应时间,min;麻一木糖分 子质量150 · 18,yg/ymol或g/mol。本发明反应底物为桦木木聚糖(Birchwood xylan,Sigma 公司)。
[0042] (三)应用酸性木聚糖酶作为烟草加工辅助添加的酶制剂的方法 我们研究发现,不同的烟草样品的品种(系)、产地或年份,作为酸性木聚糖酶水解底物 的木聚糖含量差异较大,本发明酶制剂以戊聚糖含量在11%~19%的烟草作为适宜的处理对 象。
[0043]聚戊糖或称戊聚糖是烟草半纤维素主要成分,采用间苯三酚比色法(Douglas法) (刘士清,张无敌,尹芳,等。沼气发酵实验教程。北京:化学工业出版社,2013,pl21-125)测 定烟草中聚戊糖含量,即可间接测定烟草中半纤维素含量。具体是: 取烟草样品在105°C下烘干至恒重(另精确称取1份以计含水量),粉碎过40目筛取5.0g 放入500mL的三角瓶中,加入100mL 12%Na0H溶液和50mL 2% H202,放入温度45°C的摇床 120r/min旋转摇瓶24h,3500r/min离心20min,上清液转移到烧杯中,用总量不超过50mL的 蒸馏水悬浮洗沉淀3次,洗涤沉淀离心后的洗涤液同样并入烧杯上清液中,用冰醋酸调节 pH3,加800mL无水乙醇或95%乙醇,放置过夜,离心沉淀得半纤维素,在60 °C下烘干,计算总 得率(数值可计为半纤维素的含量),得到的粗制半纤维素作为预处理的样品。Douglas法测 定原理:在冰醋酸介质中,戊聚糖被热酸水解,脱水生成糠醛后试剂与间苯三酚反应显色, 颜色深浅与木糖浓度在3 · 0mg/L~40mg/L(3yg/mL~40yg/mL)之间呈线性关系,最大吸收波 长为552nm。
[0044] 使用方法: 将酶活力为3000~4000U/mL的浓缩酸性木聚糖酶原液制剂稀释250倍作为片烟复烤前 的第二次润叶用水,该稀释后的酸性木聚糖酶酶活力范围为12~16U/mL。
[0045] 最好是,将酶活力为3500U/mL的浓缩酸性木聚糖酶制剂浓缩液成品稀释250倍作 为片烟复烤前的第二次润叶用水,其最佳酸性木聚糖酶酶活力为14 U/mL。
[0046] (四)浓缩酸性木聚糖酶原液制剂的酶活力评吸检测及效果 将5个平行测定酶活力为3518U/mL、3489 U/mL,3473 U/mL、3555 U/mL和3490 U/mL,混 合后酶活力平均为3505 U/mL。取3505 U/mL制剂lmL、2mL和3mL分别用250mL水稀释,稀释后 酶液酶活力分别是14.02U/mL、28.04U/mL和42.06U/mL。分别取25mL用喷枪均匀喷洒铺放在 托盘中的3份,计100g/份烟片,相当于4g烟样承受lmL稀释酶液,即每lg烟样分别受3.505U、 7.01U和10.515U的酸性木聚糖酶酶活力作用。然后,置于相对湿度65%,恒温35°C下快速发 酵,发酵7 d、20d和40d时分别制备成烟支,以备评吸计分。
[0047] ①云南石林板桥B2F和B3F混合烟样评吸结果(见表1) 从表1中评吸结果来看,酸性木聚糖酶对石林板桥B2F和B3F混合烟样品质均有改善提 高的作用效果。lmL的用量符合片烟复烤前的第二次润叶用水最佳酶剂量,发酵7d时,达到 了评吸值增加的最大值(除浓度值下降和对劲头无效外,各项均有所改善增值),合计值较 对照增幅14%,说明品质明显改善;20d时略有下降(表现在香气质评分值下降),40d还存在 下降的趋势(不但香气质下降,香气量也下降h2mL和3mL超出最佳酶剂量每lg