无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(1:5-1:10)，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。
[0021 ]用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清:以纯化的HER-2蛋白(10yg/ml)包被酶标板，每孔ΙΟΟμΙ，4°C包板过夜。甩掉包被液，加入200μ1 5%的脱脂奶粉，37°C封闭Ih后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清ΙΟΟμΙ (阴性对照为PBS ΙΟΟμΙ)，37°C孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μ1，室温静置5分钟，加终止液50μ1。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗HER2杂交瘤细胞株，命名为6H8，亚型鉴定为IgGl。
[0022]将选出的阳性杂交瘤细胞株6H8克隆化培养(有限稀释法)，获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人HER-2杂交瘤细胞系6H8，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.6918。
[0023](3)单克隆抗体的大量制备与纯化
将步骤(2)获得的细胞株6H8接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。单克隆抗体HER-2的纯化:采用Protein A亲和层析法。首先制备protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗HER-2的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmo I/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。
[0024](4)直接ELISA法测定纯化抗体的滴度
以纯化的HER-2蛋白(10yg/ml)包被酶标板，每孔ΙΟΟμΙ，4°C包板过夜。甩掉包被液，加入200μ1 5%的脱脂奶粉，37°C封闭Ih后，洗涤3次，将纯化的抗体按1: 200,1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400,1:12800进行稀释，以每孔ΙΟΟμΙ加入酶标板中(阴性对照为PBSΙΟΟμΙ)，37°C孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μ1，室温静置5分钟，加终止液50μ1。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:10000以上(参见图2)。
[0025]实施例2:单克隆抗体免疫组化应用检测
用HER-2单抗，按常规法作病理切片，对人乳腺癌石蜡切片进行免疫组化染色。
[0026]具体方法为
(I)脱蜡
切片依次置于二甲苯1、I1、III中脱蜡，每次5分钟，移至无水乙醇1、11中各浸泡4分钟，移至95%酒精中浸泡4分钟，移至85%酒精中浸泡4分钟，再移至70%酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟
(2)抗原修复
将已冲洗干净组织切片放入高压锅内，加入约3000ml左右的柠檬酸盐抗原修复液(PH6.0)，高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟，关掉电磁炉开关，两分钟后将高压锅移至冷水中冷却，待高压锅内抗原修复液完全冷却后，打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟
(3)阻断
将组织切片置于3ffi202中浸泡10分钟，以流水和蒸馏水分别冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈，注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗
(4)滴加一抗
甩去待测组织切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗为实施例1步骤(3)制备并纯化的HER-2单克隆抗体，稀释度为1:5000。放置在孵育盒内4°C冰箱中过夜孵育约12小时
(5)滴加二抗
将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，用PBS洗3次，每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37°C恒温箱中孵育30分钟
(6)显色、衬染、封片取出切片，擦掉组织周围的多余的ros，加入DAB显色液中显色3?5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5?10分钟，苏木素染液复染I分钟，0.5%盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5?1分钟，脱水、透明、封片、镜检结果判定:按照国外学者对组织中HER-2的判定标准，HER-2蛋白阳性反应为出现明显棕黄色颗粒，定位于细胞膜。人乳腺癌组织(参见图3)经抗HER-2抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到细胞膜出现明显棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色，说明此HER-2小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。
[0027]实施例3:单克隆抗体可变区测序根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物:
zh08 5’-GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3’ (SEQ ID NO:3)zhrll 5’-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3’ (SEQ ID NO:4)z10I 5’-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’ (SEQ ID NO:5)zlr05 5’-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3’ (SEQ ID NO:6)Trizol Reagent试剂分别提取5 X 16杂交瘤细胞6H8的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用zh08和zhrll为引物进行PCR扩增单克隆抗体HER2重链可变区，用zlOl和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体HER2轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件:94°C 5分钟;94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30个循环;72°C 7分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段(轻链长度391 bp，重链长度420 bp)。克隆到pGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后在IPTGIX-gal平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的LB液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了单克隆抗体HER2的重链和轻链可变区序列。
[0028]单克隆抗体HER-2可变区的DNA序列和氨基酸序列: 单克隆抗体册1?-2重链可变区0嫩序列(5’43’，398&?) (SEQ ID NO:7); 单克隆抗体肥卜2的轻链可变区0嫩序列(5’—3’，418匕？) (SEQ ID N0:8)；
单克隆抗体HER-2重链可变区的推断氨基酸序列(139氨基酸)(SEQ ID N0:9);
单克隆抗体HER-2轻链可变区的推断氨基酸序列(131氨基酸)(SEQ 10 ID NO: 10)。
【主权项】
1.一种以原核表达的HER-2蛋白免疫小鼠获得的分泌HER-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株6H8，保藏编号为CGMCC N0.6918。2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株6H8产生的重链可变区氨基酸序列为SEQIDN0:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 10的免疫球蛋白。
【专利摘要】一种小鼠抗人HER-2单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌HER-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为6H8，保藏编号为：CGMCC？No.？6918。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株6H8产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ？ID？NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ？ID？NO:10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测HER-2表达。CGMCC No. 691820121127
【IPC分类】C12R1/91, C12N5/20, C07K16/28
【公开号】CN105647874
【申请号】
【发明人】何小丹, 刘晨, 郝军凤
【申请人】天津三箭生物技术股份有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2015年12月30日