小鼠抗人her-2单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的利记博彩app
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及以原核表达的HER-2蛋白免疫小鼠获得的分泌HER2单克隆抗体的杂交瘤细胞株6H8，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]HER-2是定位于17号染色体短臂(17q21)的原癌基因c-erbB-2的表达产物。HER-2在人和嗤齿类中也称作c-erbB-2或neu，是一种由1255个氨基酸残基构成，相对分子质量为185kDa，具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体样蛋白，由胞外区、跨膜区及胞内区构成，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。目前已知该家族包括四个相关的蛋白酪氨酸激酶受体:HER-1 (erbB-1/EGFR)、HER-2 (erbB2/ neu)、HER-3 (erbB3)及HER-4 (erbB4)，这些蛋白酪氨酸激酶受体在细胞表面与特异的天然受体或生长因子相互作用。
[0003]HER-2在调节肿瘤细胞生长、分化及存活起着重要作用，并参与正常乳腺细胞生长和发展的调节，与肿瘤细胞的生长、侵袭和转移密切相关。通常情况下，HER-2只在胎儿期表达，到成年后，也只在极少数组织内低表达。HER-2的过表达是由原癌基因扩增或转录异常，或基因突变激活所致。在人类肿瘤中，特别是乳腺癌、卵巢癌、非小细胞癌等许多恶性肿瘤中都存在HER-2不同程度的过表达。
[0004]HER-2在肿瘤发生中起重要作用，主要通过多种途径促进细胞的增殖、分化以及抑制凋亡。与正常细胞相的HER-2基因相比，从肿瘤中分离出来的HER-2基因由于跨膜区的氨基酸序列变异而具有转化性。有报道HER-2过表达在乳腺腺病与乳腺癌质检差异有高度显著性，在癌旁上皮、乳腺癌组织学类型分级关系密切，对鉴别乳腺良恶性疾病具有辅助价值。HER-2过表达与淋巴结转移、组织学分级呈正相关，与生存期呈负相关，可作为判断乳腺癌预后的指标。
[0005]HER-2作为重要的乳腺癌预后判断因子，其阳性(过表达或扩增)乳腺癌的临床特点和生物学行为有特殊表现，治疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。HER-2状态是预后判断的制定有效治疗方案的重要参考指标，更重要的是，HER-2阳性是患者采取HER-2基因靶向治疗药物治疗的先决条件。
[0006]随着HER-2相关分子研究的深入，国内外已经获得了多种HER-2的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的HER-2的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测HER-2表达的小鼠抗人HER-2单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0008]为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:
(I)根据HER-2的基因序列(NM_001005862.1)的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增HER-2基因，构建重组表达载体PET28a- HER-2，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原；
(2)采用经典的细胞融合技术制备HER-2单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度；
(3)通过免疫组织化学分析HER-2单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片；
(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体HER-2重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到PGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体HER2的重链和轻链可变区序列。
[0009]本发明提供的以原核表达的HER-2蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌HER-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为6H8，分类命名为小鼠抗人HER-2杂交瘤细胞系，该细胞株6H8已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC N0.6918。
[0010]本发明还提供了所述杂交瘤细胞株6H8，CGMCC N0.6918产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 10。
[0011]本发明的优点和有益效果
本发明应用重组人的HER-2蛋白为免疫抗原，免疫BalbA^jnt，采用经典的细胞融合技术，通过ELI SA筛选，获得一株能稳定分泌抗HER-2的杂交瘤细胞株，命名为6H8，亚型鉴定为IgGl，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对HER2单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上;ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:10000以上。人乳腺癌石蜡切片经抗HER-2抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到细胞膜出现明显棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的HER-2单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的HER-2蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测HER-2表达。
【附图说明】
[0012]图1SDS-PAGE分析纯化后的HER-2单克隆抗体。
[0013]图2 ELISA法测定HER-2单克隆抗体滴度。
[0014]图3是免疫组织化学检测分析HER-2单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。
【具体实施方式】
[0015]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。
[0016]实施例1:杂交瘤细胞株6H8及其产生的单克隆抗体的获得
1、抗原制备
(I)获得目的基因
在该实施例中，根据HER-2的基因序列(ΝΜ_001005862.1)的编码框，设计I对特异引物: 引物1:5，-GGATCCATGAAGCTGCGGCTCCCTGC-3’ (SEQ ID NO:1)
引物2:5'-5'-CTCGAGTCACACAGGCACGTCCAG ACC_3，；(SEQ ID NO:2) Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增HER-2基因
(2)构建重组表达载体
将步骤(I)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒 PET28a-HER-2
(3)获得含重组表达质粒的表达菌种
将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞
(4)诱导表达和蛋白纯化
将步骤(2)提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至1ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，37°C，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mM IPTG诱导表达，16°〇诱导过夜，收集菌液超声，取上清用N1-NTA琼脂糖亲和层析法纯化HER-2蛋白。
[0017]2、单抗的制备和纯化
(I)、免疫动物
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。
[0018]首次免疫。纯化的重组蛋白HER-2(用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂，10yg/只，颈背部皮下多点注射；
二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白HER_2(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，10yg/只，颈背部皮下多点注射；
三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白HER_2(用适量生理盐水稀释)，不完全弗氏佐剂，10yg/只，颈背部皮下多点注射；
三次免疫后7?10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。
[0019]加强免疫(融合前3天)，用纯化的重组蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾脏融合。
[0020](2)、细胞融合
采用眼球摘除放血法处死小鼠，