。
[0027] 实施例2
[0028] (1)实验步骤如实施例1的步骤(1)。
[0029] (2)全细胞催化反应:反应体系为0.5mol/L苯丙酮酸，lmol/L氯化铵，lmol/L葡萄 糖，0.0 lmo 1/L的Tri s-盐酸缓冲液，pH 8.0，60g/L的细胞，反应体积50mL，在30 °C反应温度 下，200rpm震荡反应反应时间48h。
[0030] (3)分离与检测:反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀， 离心弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物苯丙氨酸的收率为 85.2%，e.e.值为99.9%。
[0031] 实施例3
[0032] (1)实验步骤如实施例1的步骤(1)。
[0033] (2)全细胞催化反应:反应体系为0.5mol/L苯丙酮酸，lmol/L组氨酸，lmol/L异丙 醇，0.01 mol/L的碳酸盐缓冲液，pH 9.5，50g/L的细胞，反应体积50mL，在35°C反应温度下， 200rpm震荡反应反应时间48h。
[0034] (3)分离与检测:反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀， 离心弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物苯丙氨酸的收率为 52.1%，e.e.值为99.9%。
[0035] 实施例4
[0036] (1)实验步骤如实施例1的步骤(1)。
[0037] (2)全细胞催化反应:反应体系为0.5mol/L苯丙酮酸，lmol/L丙氨酸，ImoVL木糖， 0.01 mol/L的乙酸钠冲液，pH 6.5，80g/L的细胞，反应体积50mL，在25°C反应温度下，200rpm 震荡反应反应时间48h。
[0038] (3)分离与检测:反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀， 离心弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物苯丙氨酸的收率为 59.1%，e.e.值为99.9%。
[0039] 实施例5
[0040] (1)实验步骤如实施例1的步骤(1)。
[0041 ] (2)全细胞催化反应:反应体系为0.5mol/L苯丙酮酸，lmol/L氯化铵，lmol/L半乳 糖，0.0 lmo 1/L的磷酸钾冲液，pH 8.0，40g/L的细胞，反应体积50mL，在20 °C反应温度下， 200rpm震荡反应反应时间48h。
[0042] (3)分离与检测:反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀， 离心弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物苯丙氨酸的收率为 46.5%，e.e.值为99.9%。
[0043] 实施例6
[0044] (1)实验步骤如实施例1的步骤(1)。
[0045] (2)全细胞催化反应:反应体系为0.5mol/L苯丙酮酸，lmo VL甲酸铵，lmo VL葡萄 糖，0.01m〇l/L的磷酸盐缓冲液，pH 7.5，15g/L的细胞，反应体积50mL，在40°C反应温度下， 300rpm震荡反应反应时间48h。
[0046] (3)分离与检测:反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀， 离心弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物苯丙氨酸的收率为 67.7%，e.e.值为99.9%。
[0047]底物苯丙酮酸和产物L-苯丙氨酸用高效液相色谱检测，色谱柱为Chirex 3126,检 测波长254nm(附图1、2)。其检测条件为：流动性为含有2mM的CuS〇4的95/5的水/异丙醇溶 液;流速为lml/min;柱温为35°C。
[0048] 本发明筛选得到南海芽孢杆菌(Bacillus nanhaiensis)，经过菌株培养，细胞制 备，在加入氨基供体和辅助底物情况下，细胞催化苯丙酮酸不对称还原胺化得到产物手性 苯丙氨酸。确定了该菌株全细胞催化苯丙酮酸不对称还原胺化的反应体系和反应条件。操 作方便，设备简单，在生物催化制备手性苯丙氨酸领域具有较好的工业应用前景，对于今后 生物催化专用酶源的开发和手性化合物合成方法的研究具有较为重要的意义。
【主权项】
1. 一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于包括以下步 骤： 1) 细胞液制备:将菌种接入2216L培养基中培养，得发酵液，离心获得细胞，用缓冲液重 悬、洗涤，配制成细胞液;所述菌种为南海芽孢杆菌(Bacillus nanhaiensis)DSF-15A2,所 述南海芽抱杆菌(1^(：;[11113 11&1111&丨6118丨8)03?-15六2已于2014年03月25日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.8969; 2) 全细胞催化反应:在步骤1)得到的细胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供体作为底物，再 加入辅助底物用于辅酶循环再生，反应后得到含有产物L-苯丙氨酸的反应液； 3) 分离与检测：将步骤2)得到的含有产物L-苯丙氨酸的反应液离心去除沉淀，上清液 加入等量的甲醇，震荡混合均匀，离心去除沉淀，上清液稀释后进行测定，苯丙酮酸的浓度 用高效液相色谱检测，产物L-苯丙氨酸的浓度和对映体过量值用高效液相色谱测定，所述 沉淀为蛋白质。2. 如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步骤1)中，所述菌种接入的量按质量百分比为2216L培养基的1%;所述2216L培养基 的组成可为：1~15. Og/L蛋白胨，1~10.0 g/L酵母粉，0.1~lg/L牛肉膏，0.1~2g/L柠檬酸 钠，0.1~lg/L NH4N03，0.1~2g/L乙酸钠，用海水配制至1L。3. 如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步骤1)中，所述培养的条件为:起始PH6.5~8.0，装液量体积分数为5%~15%，培养 温度20~40 °C，摇床转速150~250rpm，培养时间12~48h;所述离心的条件可为:在冷冻离 心机中，4°C，8000rpm，离心 15min。4. 如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步骤1)中，所述缓冲液采用浓度〇. 01~〇. 2mol/L，pH为7~13的Tris-盐酸、乙酸钠、 碳酸钠、磷酸钾中至少一种，优选pH 8的Tris-盐酸缓冲液。5. 如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步骤1)中，所述重悬的条件为弃上清液，沉淀用Tris-盐酸缓冲液重悬，pH 6.5~ 8.0;所述洗涤可重复操作3次;所述细胞液的质量浓度可为0.025~100g/L。6. 如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步骤2)中，所述氨基供体选自丙氨酸、氨水、NH 4C1、NH4N03、甲酸铵中的一种，优选氨 水或NH4C1。7. 如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步骤2)中，所述辅助底物选自葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖、异丙醇中的至少一种，优 选葡萄糖和甘油中的至少一种。8. 如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步骤2)中，所述反应的条件为pH 7~13,反应温度20~50°C，震荡速率100~300rpm， 反应时间30~180h。9. 如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步骤3)中，所述高效液相色谱测定，色谱柱为手性柱Chirex 3126柱，检测波长 254nm，检测条件为:流动性为含有2mM的CuS〇4的95/5的水/异丙醇溶液;流速为lml/min;柱 温为35°C。
【专利摘要】一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，涉及手性苯丙氨酸。将菌种接入2216L培养基中培养，得发酵液，离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液；所述菌种为南海芽孢杆菌(Bacillus？nanhaiensis)DSF-15A2，保藏中心登记入册编号为CGMCC？No.8969；在细胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供体作为底物，再加入辅助底物用于辅酶循环再生，反应后得到含有产物L-苯丙氨酸的反应液，离心去除沉淀，上清液加入等量的甲醇，震荡混合均匀，离心去除沉淀，上清液稀释后进行测定，苯丙酮酸的浓度用高效液相色谱检测，产物L-苯丙氨酸的浓度和对映体过量值用高效液相色谱测定。CGMCC No.896920140325
【IPC分类】C12N1/20, C12P13/22, C12R1/07
【公开号】CN105647835
【申请号】
【发明人】方柏山, 任红, 王世珍
【申请人】厦门大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年8月8日