一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及手性苯丙氨酸(L-苯丙氨酸），尤其是涉及一种海洋菌株催化不对称还 原制备手性苯丙氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] 手性氨基酸(天然L-氨基酸和非天然D-氨基酸)是合成手性药物、手性农药和手性 食品添加剂等精细化工品的关键中间体。许多新药(如蛋白酶抑制剂类、抗艾滋病药等）的 制备需要使用人工合成的非天然手性氨基酸。而众多手性氨基酸的合成离不开氧化还原酶 的催化，因此寻找高选择性的氧化还原酶成为手性氨基酸研究的热点。
[0003] 苯丙氨酸主要用作试剂及医药上的胃肠外营养输液，亦见用作特殊人员合成膳 食、必需氨基酸片等营养强化剂的成分。L-苯丙氨酸是合成一些抗癌药物的中间体和良好 载体，通过L-苯丙氨酸可以把抗肿瘤药物载入肿瘤所在的部位，不但可以抑制肿瘤生长，而 且又可降低肿瘤药物的毒性。随着甜味剂二肽阿斯巴甜(APM)投放市场，L-苯丙氨酸作为它 的主要原料，需求量急剧增加 （Gerigk MR，Maass D，Kreutzer A，et al .Enhanced pilot-scale fed-batch L-phenylalanine production with recombinant Escherichia coli by fully integrated reactive extraction[J].Bioprocess Biosyst Eng，2002,25:43-52)』-苯丙氨酸营养价值虽小，但具有出色的镇疼作用。临床实验已表明，对一批长期用各 种疗法无效的肌肉疼、关节疼、腰腿疼患者疗效显著，并且无明显副作用。
[0004] 苯丙氨酸在人体内不能合成，必须由外界供给，因此研究其合成方法很有必要。苯 丙氨酸的制备方法通常有两种，即化学合成法和微生物发酵法。化学合成法的收率较低;需 使用剧毒的氰化物，污染环境;副反应较多；工艺路线长等缺点。而微生物发酵法具有环境 友好，节能绿色等优点，缺点是发酵产物浓度低，生产周期长，工艺管理要求严格。全细胞催 化苯丙酮酸不对称还原胺化获得手性苯丙氨酸，具有反应路线简洁，易实现辅酶再生等优 点。1984年，Humme等人（Wemer Humme，Norbert Weiss · Isolation and characterization of a bacteria possessing L-phenylalanine dehydrogenase activity[J]Arch Michobiol，1984,137 :47_52)首次报道具有苯丙氨酸脱氢酶的短杆菌(1^6￥；^3(^61'；[11111 sp.)，通过与甲酸脱氢酶反应体系相偶联，使辅酶NADH得以再生，使得在同一个生物反应器 中连续转化苯丙酮酸生成L-苯丙氨酸。因此，筛选含有催化不对称还原胺化高活性高选择 性的苯丙氨酸脱氢酶的菌株是实现手性苯丙氨酸有效制备的关键。来源于海洋微生物的氧 化还原酶具有一些陆地酶所不具有的特性，如广泛的底物谱、耐盐性、耐有机溶剂等特性， 使得其受到更多的关注。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法。
[0006] 所述海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：
[0007] 1)细胞液制备:将菌种接入2216L培养基中培养，得发酵液，离心获得细胞，用缓冲 液重悬、洗涤，配制成细胞液；所述菌种为南海芽孢杆菌(Bacillus nanhaiensis)DSF-15八2，所述南海芽抱杆菌(1^(3；[11118 11&11]1&丨6118丨8)03?-15六2已于2014年03月25日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No. 8969， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101;
[0008] 在步骤1)中，所述菌种接入的量按质量百分比可为2216L培养基的1%;所述2216L 培养基的组成可为：1~15. Og/L蛋白胨，1~10.0 g/L酵母粉，0.1~lg/L牛肉膏，0.1~2g/L 柠檬酸钠，0.1~lg/L NH4N〇3,0.1~2g/L乙酸钠，用海水配制至1L;所述培养的条件可为:起 始pH6.5~8.0，装液量体积分数为5 %~15 %，培养温度20~40 °C，摇床转速150~250rpm， 培养时间12~48h;所述离心的条件可为:在冷冻离心机中，4°C，8000rpm，离心15min;所述 缓冲液可采用浓度0.01~〇.2mol/L，pH为7~13的Tris-盐酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸钾等中 至少一种，优选pH 8的Tris-盐酸缓冲液;所述重悬的条件可为弃上清液，沉淀用Tris-盐酸 缓冲液重悬，pH 6.5~8.0;所述洗涤可重复操作3次;所述细胞液的质量浓度可为0.025~ 100g/L〇
[0009] 2)全细胞催化反应:在步骤1)得到的细胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供体作为底 物，再加入辅助底物用于辅酶循环再生，反应后得到含有产物L-苯丙氨酸的反应液；
[0010] 在步骤2)中，所述氨基供体可选自丙氨酸、氨水、NH4C1、NH4N03、甲酸铵等中的一 种，优选氨水或NH 4C1;所述辅助底物可选自葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖、异丙醇等中的至少 一种，优选葡萄糖和甘油中的至少一种；所述反应的条件可为pH 7~13,反应温度20~50 °C，震荡速率100~300rpm，反应时间30~180h。
[0011] 3)分离与检测：将步骤2)得到的含有产物L-苯丙氨酸的反应液离心去除沉淀，上 清液加入等量的甲醇，震荡混合均匀，离心去除沉淀(蛋白质），上清液稀释后进行测定，苯 丙酮酸的浓度用高效液相色谱检测，产物L-苯丙氨酸的浓度和对映体过量值用高效液相色 谱测定。
[0012] 在步骤3)中，所述高效液相色谱测定，色谱柱为手性柱Chirex 3126柱，检测波长 254nm，检测条件为:流动性为含有2mM的CuS〇4的95/5的水/异丙醇溶液;流速为lml/min;柱 温为35°C。
[0013] 本发明所述菌株全细胞催化苯丙酮酸制备L-苯丙氨酸，是利用全细胞中苯丙氨酸 脱氢酶的高度对映体选择性，催化苯丙酮酸的不对称还原胺化，获得L-苯丙氨酸，葡萄糖等 辅助底物加入用于辅酶NADH的循环再生。其以葡萄糖为辅助底物的化学反应式如下：
[0014]
[0015] 本发明的有益效果如下：
[0016] 本发明从海洋微生物筛选获得含有依赖NADH的苯丙氨酸脱氢酶的不同以往报道 的新菌株。本发明还考察了氨基供体、反应缓冲液、PH、温度等影响，优化了该菌株全细胞催 化苯丙酮酸不对称还原胺化制备L-苯丙氨酸的反应体系和反应条件。
[0017] 所获产物手性苯丙氨酸的光学纯度达到90%以上，收率达45%以上。本发明操作 方便，具有产品光学纯度高、收率高，设备简单等优点，在生物催化制备手性苯丙氨酸领域 具有较好的工业应用前景。
【附图说明】
[0018] 图1为苯丙酮酸的色谱分析图。
[0019] 图2为产物L-苯丙氨酸的手性色谱分析图。
[0020] 图3为L-苯丙氨酸和D-苯丙氨酸的手性色谱分析图。
【具体实施方式】
[0021 ]下面通过实施例对本发明做详细说明 [0022] 实施例1
[0023] (1)南海芽孢杆菌(Bacillus nanhaiensis)DSF_15A2的培养：以1%的接种量，将 菌种接入500mL 2216L培养基中。2216L培养基的组成为10 . Og/Ι蛋白胨，5 . Og/L酵母粉， 〇. 5g/L牛肉膏，0.5g/L柠檬酸钠，0.2g/L NH4N03，1. Og/L NaAc，用海水配置。培养条件为:起 始pH 7.0,装液量体积分数为10%，培养温度25°C，摇床转速200rpm，培养时间24h。
[0024]细胞的制备:培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4°C，8000rpm，15min) 获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次 获得细胞。
[0025] (2)全细胞催化反应:反应体系为0 · lmol/L苯丙酮酸，lmol/L NH4CI，lmol/L甘油， 0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液，pH 9.0，100g/L的细胞，反应体积50mL，在30°C反应温度下， 1 OOrpm震荡反应反应时间48h。
[0026] (3)分离与检测:反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀， 离心弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物苯丙氨酸的收率为 79.6%，e.e.值为99.9%