轻轻冲洗后进行SERS液相测试， 评估核酸SERS传感器对于血清样品的特异性和灵敏度。
[0041 ] (6)工作曲线：用10% 的人血清分散等量 microRNA-21、microRNA_486 和 microRNA-375，配置得到浓度lfM，10fM，100fM，ΙρΜ，ΙΟρΜ，ΙΟΟρΜ，InM的三种核酸的混合溶液;将核酸 SERS传感器与不同浓度的待检测物溶液中，在37°C恒温杂交反应2h;取出传感器用缓冲液 冲洗后进行SERS测试，检测得到R0X、Cy5和FAM的信号，作microRNA-21浓度和R0X的SERS信 号强度变化量的工作曲线，作micr 〇RNA-486浓度和Cy5的SERS信号强度变化量的工作曲线， 对microRNA-375浓度和相应FAM的SERS信号强度变化量的工作曲线。
[0042] (7)SERS传感器用于三元核酸检测方法:将上述传感器与待检测的血清样品溶液 共培养，在37°C恒温箱杂交反应2h;取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS测试，检测到 的SERS信号强度与工作曲线对照，得出待检测样品中目标核酸的浓度。
[0043]本发明的传感器以银纳米棒阵列型SERS基片为载体，通过在银棒表面有序地组装 带有染料分子的发卡型核酸探针链，制备得到用于多种肿瘤miRNA标志物联合检测的SERS 传感器，并公开了该类传感器用于血清样品中多种低丰度核酸肿瘤核酸标志物的快速、联 合检测方法，为拓展SERS技术在肿瘤早期检测中的广泛应用提供了技术支持。
[0044]有益效果:本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0045]本发明利用银纳米棒阵列型SERS基片作为检测基片，具有优异的SERS性能，探针 链通过金-硫键组装到银纳米棒阵列型SERS基片表面，在基片表面分布具有更优的均一性 和稳定性;设计特殊的发夹型探针链结构使得检测结构简单有效;采用的固态SERS基片作 为检测基片在样品分离提纯方面优势明显(相比于离心等提纯方式），固态基底通过冲洗可 实现生物分子的快速分离，无设备要求，操作简单;该传感器检测限达到飞摩尔级(?0,可 实现多种核酸标志物的联合检测。本发明公开的传感器制备简单、检测灵敏度高、可靠性 好，在肿瘤早期诊断等领域有广泛的应用前景。本发明的核酸SERS传感器具有结构简单、制 备方便等优点，并且具有良好的检测灵敏度，检测限可低于lfM，可以用于检测早期肿瘤血 液样本中的低丰度核酸标志物;同时对各种核酸具有良好的普适性。
【附图说明】
[0046]图1是多元核酸检测SERS传感器构建及工作原理图。
[0047]图2是SERS传感器在缓冲液中单元检测对应非互补、单碱基错配、互补miRNA的 SERS谱图。
[0048]图3是SERS传感器在缓冲液中单元检测对应非互补、单碱基错配、互补miRNA的 SERS谱图中1503cm-1处峰值统计。
[0049] 图4是多元血清样品检测的特异性表征:miRNA-21传感器检测结果(R0X探针）。
[0050] 图5是多元血清样品检测的特异性表征:miRNA-486传感器检测结果(Cy5探针）。
[0051] 图6是多元血清样品检测的特异性表征:miRNA-375传感器检测结果(FAM探针）。
[0052] 图7是SERS传感器用于血清样品三元检测时对应miRNA-21的工作曲线。
[0053] 图8是SERS传感器用于血清样品三元检测时对应miRNA-486的工作曲线。
[0054] 图9是SERS传感器用于血清样品三元检测时对应miRNA-375的工作曲线。
【具体实施方式】
[0055]以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不限于所举的实 施例。
[0056]以下实施例中银纳米棒阵列型SERS基片采用真空电子束蒸发镀膜技术制备，具体 方法按文献C. Y. Song，J. L. Abell，Υ· P. He，S .H.Murph，Υ· P. Cui，Υ·Ρ · Zhao .Gold-modified silver nanorod arrays:growth dynamics and improved SERS properties.Journal of Materials Chemistry ,2012,22(3) :1150-1159.中报到的方法制备。
[0057] 以下实施例中所述示例的3种检测核酸碱基序列为：
[0058] microRNA-21:5，-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3'
[0059] microRNA-486:5'-UCC UGU ACU GAG CUG CCC CGA G-3'
[0060] microRNA-375:5'-UUU GUU CGU UCG GCU CGC GUG A-3'
[0061] 所述示例的3种发卡型探针链对应的核酸片段碱基序列为：
[0062] 探针链1:5'-R0X-CCG TTC TAT CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA TAG AAC GGT TTT T-(CH2)6-SH-3'；
[0063] 探针链2:5'-Cy5-CCG TTC TAC TCG GGG CAG CTC AGT ACA GGA TAG AAC GGT TTT T-(CH2)6-SH-3'；
[0064] 探针链3:5'-FAM-CCG TTC TAT CAC GCG AGC CGA ACG AAC AAA TAG AAC GG T TTT T-(CH2)6-SH-3'。
[0065] 实施例1单元检测microRNA-21的SERS传感器及其制备和检测方法
[0066] (1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗；
[0067] (2)将探针链l(luM)先进行高温冷却处理，即在95°C恒温摇床中保持5min，再在4 °C冰箱保持20min，用于提纯发卡型核酸链；
[0068] (3)取20uL探针链l(luM)滴于SERS基片，在25°C，80%湿度环境中静置3h，然后用 缓冲液（10mM磷酸盐，100mM氯化钠 ，pH 7.4)冲洗干净;修饰探针链的SERS基底在缓冲液 (lOmM磷酸盐，lOOmM氯化钠，pH 7.4)中浸泡20min，使DNA形态保持稳定；
[0069] (4)用ImM疏基己醇溶液浸泡lOmin，封闭基片表面裸露的位点，并用缓冲液轻轻冲 洗干净，制备得到单元检测的核酸SERS传感器。
[0070] (5)特异性检测:分别将目标检测物micr〇RNA-21、单碱基错配核酸、完全不互补核 酸用缓冲液稀释成ΙΟΟρΜ的核酸溶液;将核酸SERS传感器置于不同核酸液溶中，在37°C恒温 箱杂交反应2h;分别取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS液相测试，评估核酸SERS传 感器的特异性，结果见图2。
[0071] (6)工作曲线：将检测物microRNA-21用缓冲液稀释至不同浓度100aM，lfM，10fM， 10 0 f Μ，1 p Μ，10 p Μ，10 0 p Μ的核酸溶液；将核酸S E R S传感器置于不同浓度的待检测物 microRNA-21液溶中，在37°C恒温箱杂交反应2h;取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS 液相测试，对目标核酸分子浓度和相应SERS信号强度作出核酸传感器的工作曲线，并计算 传感器对这种目标核酸分子的线性范围和检测下限。（拉曼测试条件:扫描时间ls，激光功 率10%，物镜放大倍率5x，累计次数5次，激发光波长633nm。）
[0072] (7)SERS传感器用于单元核酸检测方法:将上述传感器置于待检测的microRNA-21 溶液，在37 °C恒温箱杂交反应2h;取出传感器用缓冲液轻轻冲洗后进行SERS液相测试，检测 到的SERS信号强度与工作曲线对照，计算得出待检测样品的浓度。
[0073] SERS检测结果表明，SERS传感器可有效识别肺癌标志物micro RNA 21，SERS特征 峰信号强度与初始信号的差值在RNA浓度区间100aM~100pM呈线性关系，最低检测极限达 至 IJlOOaM。
[0074] 实施例2 microRNA