用于核酸检测的sers传感器及其制备和多元检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于功能纳米材料和生物检测领域，具体涉及一种用于核酸检测的SERS (表面增强拉曼散射)传感器及其制备方法和多元检测方法。
【背景技术】
[0002] 近年来研究证明miRNA的表达失控与肿瘤的发生发展密切相关，miRNA在特定组织 及特定发育阶段表达，具有组织特异性和时序性，这就决定了miRNA在疾病诊断中的重要作 用。然而在病变的早期这些肺癌标志物含量很低，常规临床检测技术因其灵敏度的限制，容 易对标志物产生漏检;而且至今尚未发现敏感度和特异性倶佳的单一肺癌标志物;此外，月中 瘤标志物检测的样本一般是血液或组织，通常成分复杂，测试结果易受干扰，影响检测可靠 性。针对肿瘤早期发现这一关键性问题，迫切需要发展便捷、灵敏、价格低廉的高灵敏检测 新方法，对多种肺癌标志物实行联合检测。目前已公开的用于核酸检测的表面增强拉曼散 射传感器比较少，针对血清中多元核酸标志物联合检测的方法还比较匮乏。因此，开发用于 核酸标志物检测，尤其是痕量肿瘤核酸标志物检测的高性能SERS传感器，用于多种肿瘤 miRNA标志物的联合检测是迫切需求。
【发明内容】
[0003] 本发明提供一种用于核酸检测的表面增强拉曼散射(SERS)传感器及其制备方法 和多元检测方法。该传感器以银纳米棒阵列型SERS基片为载体，经表面修饰特定核酸探针 链构建得到，本发明同时提供了利用该核酸传感器的多元检测方法。
[0004] 本发明采用的技术方案为：
[0005] 用于核酸检测的SERS传感器，该传感器由固体SERS基片和核酸探针链构成，核酸 探针链通过金-硫键固定于固体SERS基片的表面，与目标核酸分子碱基互补配对后，通过检 测探针链上拉曼分子的SERS信号变化，实现对核酸的传感检测。
[0006] 基片表面的裸露位点用巯基己醇封闭。
[0007] 所述固体SERS基片为银纳米棒阵列型基片。
[0008] 所述的核酸探针链3 '端修饰巯基，5 '端修饰染料分子，探针链中部分碱基序列互 补可形成发卡型结构，部分碱基序列与待检测核酸可互补配对。
[0009] 所述染料分子为本领域常规的标记染料，包括但不限于R0X、Cy5、FAM等染料。
[0010]所述核酸探针链的浓度优选为luM。
[0011] 核酸探针链和目标核酸分子数量相等，每个核酸探针链对应一个目标核酸分子， 构成一组互补杂交双链结构。
[0012] 所述的用于核酸检测的SERS传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0013] 1)制备固体SERS基片，然后用纯水多次冲洗；
[0014] 2)取核酸探针链滴于固体SERS基片与固体SERS基片共培养，然后用缓冲液冲洗干 净;修饰探针链的SERS基底在缓冲液中浸泡，使DNA形态保持稳定；
[0015] 3)用巯基己醇封闭基片表面裸露的位点，并用缓冲液轻轻冲洗干净，制备得到核 酸检测SERS传感器。
[0016] 步骤2)中所述共培养条件为在25°C，80%湿度环境中静置培养3h。
[0017] 步骤2)中浸泡时间为10~30min。
[0018] 所述的SERS传感器检测核酸的多元检测方法，将SERS传感器与待测样品溶液共培 养后，用缓冲液冲洗进行SERS测试得到SERS信号，对照工作曲线计算得出待测样品中目标 核酸的浓度。
[0019] 所述工作曲线是将SERS传感器分别与含有多种目标核酸的不同浓度血清样品溶 液共培养，得到不同浓度样品检测的SERS信号强度，以核酸浓度为横坐标，以SERS信号强度 变化量为纵坐标做出工作曲线。
[0020] 所述SERS传感器与待测样品溶液共培养条件为:在37°C，杂交反应2h。
[0021] 本发明传感器基于银纳米棒阵列型SERS基片制作得到，首先选择特定的检测探针 链，该探针链为可以与待检测核酸分子进行碱基互补配对，具有发卡型结构且带有染料分 子的核酸片段，然后将上述探针链固定在银纳米棒阵列基片表面制备得到核酸SERS传感 器。将待检测核酸滴加到上述传感器并培养，通过检测染料分子的SERS信号及其强度实现 对待检测核酸的定性定量检测。
[0022]本发明中银纳米棒阵列型SERS基片采用真空电子束蒸发镀膜技术制备，具体方法 按文献（C · Y. Song，J · L · Abel 1，Υ · P · He，S · H.Murph，Y.P.Cui，Y.P. Zhao · Gold-modified silver nanorod arrays:growth dynamics and improved SERS properties.Journal of Materials Chemistry,2012,22(3) :1150-1159.)中报到的方法制备。
[0023] 本发明SERS传感器可以用于单元、双元及多元检测核酸，根据探针种类来实现混 合核酸的检测。
[0024] 以检测肺癌核酸标志物microRNA-21、microRNA_486和microRNA-375为不例制备 用于三元检测的核酸SERS传感器。
[0025] 所述示例的3种检测核酸碱基序列为：
[0026] microRNA-21:5'-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3'
[0027] microRNA-486:5，-UCC UGU ACU GAG CUG CCC CGA G-3'
[0028] microRNA-375:5'-UUU GUU CGU UCG GCU CGC GUG A-3'
[0029] 所述示例的3种发卡型探针链对应的核酸片段碱基序列为：
[0030] 探针链1:5'-R0X-CCG TTC TAT CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA TAG AAC GGT TTT T-(CH2)6-SH-3'；
[0031] 探针链2:5'-Cy5-CCG TTC TAC TCG GGG CAG CTC AGT ACA GGA TAG AAC GGT TTT T-(CH2)6-SH-3'；
[0032] 探针链3:5'-FAM-CCG TTC TAT CAC GCG AGC CGA ACG AAC AAA TAG AAC GG T TTT T-(CH2)6-SH-3'。
[0033] 本发明制备用于核酸检测的SERS传感器的优选方案中，核酸探针链3'端修饰巯 基，5 '端修饰染料分子R0X、FAM或者Cy5，探针链中部分碱基序列互补可形成发卡型结构，部 分碱基序列与待检测核酸可互补配对。探针链通过金-硫键固定于银纳米棒阵列型SERS基 底的表面，基底表面的裸露位点用疏基己醇封闭。
[0034]本发明制备用于核酸检测的SERS传感器的优选方案中，发卡型核酸探针链和目标 核酸(待检测)分子部分碱基互补，每个发卡型核酸探针链均对应与一个目标核酸分子互补 杂交，构成一组互补杂交双链结构。互补配对后，探针链的发夹型茎环打开，5'端修饰的染 料分子远离SERS基底。
[0035]本发明中制备上述用于核酸检测的SERS传感器，包括如下具体步骤（以三元检测 传感器为例）：
[0036] (1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗；
[0037] (2)将探针链l(luM)、探针链2(luM)和探针链3(luM)分别进行高温冷却处理，即在 95°C恒温摇床中保持5min，再在4°C冰箱保持20min，用于提纯发卡型DNA链；
[0038] (3)取三种核酸探针链（luM)各20uL分别滴于SERS基片，在25°C，80%湿度环境中 孵育3h，然后用缓冲液冲洗干净;修饰探针链1、2和3的SERS基片在缓冲液中浸泡20min，使 DNA探针链形态保持稳定；
[0039] (4)用巯基己醇封闭基片表面裸露的位点，并用缓冲液轻轻冲洗干净，制备得到用 于三元核酸检测的SERS传感器。
[0040] (5)特异性检测：分别将不同血清样(见表1)和上述三元检测核酸SERS传感器共同 孵育，在37°C恒温箱杂交反应2h;分别取出传感器用缓冲液