7、往蜜蜂巢脾多糖提取液C中加入占其体积3-5倍的无水乙醇，在0-26Γ下醇 析4-24h后，进行4000r-10000r/min的离心操作10-30min，弃上清液并鼓风干燥挥发干乙 醇，得到蜜蜂巢脾多糖提取物。
[0042] 本发明提供的一种蜜蜂巢脾多糖提取物的制备方法实施方式，能够从蜜蜂巢脾中 提取多糖提取物，能够增加蜜蜂巢脾的利用价值，且生产工艺简单，成本较低。
[0043] 实施例1
[0044] 本实施例一种蜜蜂巢脾多糖提取物的制备方法，包括步骤：
[0045] 步骤 1、将西方蜜蜂Apis mellifera L. (Apis mellifera Linnaeus)的三年以上 的巢脾，_20°C冷冻4h以上，粉碎后过50目筛，巢脾粉使用乙醚回流除蜡，除蜡后鼓风烘干， 挥发乙醚，得到巢脾干燥粉末。
[0046] 本实施中，西方蜜蜂(Apis mellifera Linnaeus)，为蜜蜂属中型体中等的一种， 产于西方，简称西蜂。主要的西方蜜蜂亚种有：意大利蜜蜂(A.m. ligustica)、卡尼鄂拉蜂 (八.111.031'11；^3)、高加索蜜蜂(厶.111.0311038；^3)、欧洲黑蜂(厶.111.1116111€6^)、突尼斯蜜蜂 (A.m. intermissa)、东非蜜蜂(A.m. scutelata)和安纳托利亚蜜蜂(A.m.anatolica)等。 [0047]步骤2、在巢脾干燥粉末中加入巢脾干燥粉末质量10倍以上的蒸馏水后，加入木瓜 蛋白酶进行酶解得到酶解液;其中，木瓜蛋白酶添加量为每l〇〇g巢脾干燥粉末添加7.2万U， 酶解温度为40 °C，酶解时间0.5h;
[0048] 步骤3、将所述酶解液通过120目纱布过滤，取上清液；
[0049] 步骤4、在进行步骤3操作后所得的滤渣中，再加入10倍以上的蒸馏水后，加入7.2 万U/100g巢脾干燥粉末的木瓜蛋白酶重复上述酶解及过滤操作1次;将取得的上清液合并， 到蜜蜂巢脾多糖提取液A;
[0050] 步骤5、将所述蜜蜂巢脾多糖提取液A利用旋转蒸发仪在80°C下进行浓缩lh，离心 后弃去沉淀得到蜜蜂巢脾多糖提取液B;
[0051] 步骤6、往蜜蜂巢脾多糖提取液B中加入占其体积1/4的由氯仿和正丁醇配制成的 混合液，充分抽提20min后，进行4000r/min的离心操作10min，取上清液;其中，在制成的所 述混合液中，氯仿和正丁醇的体积比为4:1;对获取的所述上清液再重复本步骤的操作3次， 获得去蛋白蜜蜂巢脾多糖提取液C;
[0052]步骤7、往蜜蜂巢脾多糖提取液C中加入占其体积3倍的无水乙醇，在室温下醇析 24h后，进行4000r/min的离心操作5min，弃上清液并鼓风干燥挥发干乙醇，得到蜜蜂巢脾多 糖提取物。
[0053]本实施例制备的蜜蜂巢脾多糖提取物为浅褐色粉末，易吸湿，易溶于水，得率为 10.26%，多糖质量含量为33.14%。
[0054] 实施例2
[0055]本实施例一种蜜蜂巢脾多糖提取物的制备方法，包括步骤：
[0056]步骤1、将意大利蜜蜂的三年以上的巢脾，-20°C冷冻4h以上，粉碎后过100目筛，巢 脾粉使用乙醚回流除蜡，除蜡后鼓风烘干，挥发乙醚，得到巢脾干燥粉末。
[0057]步骤2、在巢脾干燥粉末中加入巢脾干燥粉末质量15倍以上的蒸馏水后，加入食品 级的木瓜蛋白酶进行酶解得到酶解液;其中，木瓜蛋白酶添加量为每l〇〇g巢脾干燥粉末添 加9.6万U，酶解温度为50 °C，酶解时间1.5h;
[0058] 步骤3、将所述酶解液通过120目纱布过滤，取上清液；
[0059] 步骤4、在进行步骤3操作后所得的滤渣中，再加入15倍以上的蒸馏水后，加入9.6 万U/100g巢脾干燥粉末的木瓜蛋白酶重复上述酶解及过滤操作2次;将取得的上清液合并， 到蜜蜂巢脾多糖提取液A;
[0060] 步骤5、将所述蜜蜂巢脾多糖提取液A在90°C下进行浓缩2h，离心后弃去沉淀得到 蜜蜂巢脾多糖提取液B;
[0061] 步骤6、往蜜蜂巢脾多糖提取液B中加入占其体积1/4的由氯仿和正丁醇配制成的 混合液，充分抽提20min后，进行8000r/min的离心操作10min，取上清液;其中，在制成的所 述混合液中，氯仿和正丁醇的体积比为4:1;对获取的所述上清液再重复本步骤的操作3次， 获得去蛋白蜜蜂巢脾多糖提取液C;
[0062] 步骤7、往蜜蜂巢脾多糖提取液C中加入占其体积4倍的无水乙醇，在4°C下醇析12h 后，进行8000r/min的离心操作20min，弃上清液并鼓风干燥挥发干乙醇，得到蜜蜂巢脾多糖 提取物。
[0063] 本实施例制备的蜜蜂巢脾多糖提取物为浅褐色粉末，易吸湿，易溶于水，得率为 21.46%，多糖质量含量为78.02%。
[0064] 实施例3
[0065] 本实施例一种蜜蜂巢脾多糖提取物的制备方法，包括步骤：
[0066]步骤1、将意大利蜜蜂的三年以上的巢脾，-20°C冷冻4h以上，粉碎后过120目筛，巢 脾粉使用乙醚回流除蜡，除蜡后使用80%v/v乙醇进行脱脂脱单糖处理;进行脱脂脱单糖处 理后，鼓风烘干，得到巢脾干燥粉末；
[0067]步骤2、在巢脾干燥粉末中加入巢脾干燥粉末质量20倍以上的蒸馏水后，加入木瓜 蛋白酶进行酶解得到酶解液;其中，木瓜蛋白酶添加量为每l〇〇g巢脾干燥粉末添加12万U， 酶解温度为60°C，酶解时间lh;
[0068] 步骤3、将所述酶解液通过120目纱布过滤，取上清液；
[0069]步骤4、在进行步骤3操作后所得的滤渣中，再加入20倍以上的蒸馏水后，加入12万 u/100g巢脾干燥粉末的木瓜蛋白酶，重复上述酶解及过滤操作1次;将取得的上清液合并， 到蜜蜂巢脾多糖提取液A;
[0070] 步骤5、将所述蜜蜂巢脾多糖提取液A在100°C下进行浓缩3h，离心后弃去沉淀得到 蜜蜂巢脾多糖提取液B;
[0071] 步骤6、往蜜蜂巢脾多糖提取液B中加入占其体积1/4的由氯仿和正丁醇配制成的 混合液，充分抽提20min后，进行10000r/min的离心操作lOmin，取上清液;其中，在制成的所 述混合液中，氯仿和正丁醇的体积比为4:1;对获取的所述上清液再重复本步骤的操作3次， 获得去蛋白蜜蜂巢脾多糖提取液C;
[0072]步骤7、往蜜蜂巢脾多糖提取液C中加入占其体积5倍的无水乙醇，在0°C下醇析4h 后，进行l〇〇〇〇r/min的离心操作10min，弃上清液并鼓风干燥挥发干乙醇，得到蜜蜂巢脾多 糖提取物。
[0073] 本实施例制备的蜜蜂巢脾多糖提取物为浅褐色粉末，易吸湿，易溶于水，得率为 13.57%，多糖质量含量为64.01 %。
[0074] 本发明实施例还提供一种蜜蜂巢脾多糖提取物，所述蜜蜂巢脾多糖提取物中包括 多糖，且多糖的含量大于50 %。
[0075]进一步地，所述蜜蜂巢脾多糖提取物中，总多糖含量为20-80%。
[0076] 本发明实施例提供的一种蜜蜂巢脾多糖提取物，可采用前述任一实施例所述的蜜 蜂巢脾多糖提取物的制备方法获得。
[0077] 本发明实施例提供的一种蜜蜂巢脾多糖提取物，能够从蜜蜂巢脾中提取，从而能 够增加蜜蜂巢脾的利用价值，且生产工艺简单，成本较低。
[0078] 下面结合实验，对本发明实施例进行说明。
[0079] 1、木瓜蛋白酶提取蜜蜂巢脾多糖的单因素实验如下：
[0080]精确称取一定量的粉料，在其他条件都相同的情况下，分别考虑水浴时间（0.5h、 111、1.511、211、2.511)、水浴温度（30°(：、40°(：、50°(：、60°(：)和酶添加量(2.4、4.8、7.2、9.6、12万 U/100g)这三个单因素对蜜蜂巢脾多糖提取率的影响。
[0081] 1.1温度对蜜蜂巢脾多糖提取的影响
[0082] 固定7.2万U/100g木瓜蛋白酶添加量，酶解2h，于30 °C，40 °C，50 °C，60 °C水浴酶解， 研究温度对提取蜜蜂巢脾多糖的影响。
[0083]在酶催化反应中，温度是重要参数之一。图2为酶解温度对提取蜜蜂巢脾多糖的影 响曲线图。
[0084]由图2可以看出，随着酶解温度的升高，蜜蜂巢脾多糖得率亦随之增加，在60°C时 提取率最高，几乎是30°C的四倍。当温度超过60°C后，酶就会失活，因此采用60°C热水浸提 是最佳的选择。
[0085] 1.2水浴时间对蜜蜂巢脾多糖提取的影响
[0086] 固定7.2万U/g木瓜蛋白酶添加量，酶解温度50 °C，酶解0.5h，lh，1.5h，2h，2.5h，研 究酶解时间