对提取蜜蜂巢脾多糖的影响。
[0087] 酶解时间和酶解进行程度有着密切的关系，提取时间太短，酶解进行的不充分，而 当多糖溶解达到平衡时，酶解时间的延长并不能显著增加其得率。图3为酶解时间对提取蜜 蜂巢脾多糖的影响曲线。由图3可以看出，随着水浴时间的延长，多糖提取率增加，但当时间 超过1.5h时，多糖提取率开始下降。这可能是由于某些糖苷键因提取时间过久在蛋白酶的 催化作用下被分解了，或者是浸提时间太长引起多糖结构发生变化甚至使碳环裂解导致 的。因此当酶解时间为1.5h时，多糖提取比较稳定，所以初步确定最佳提取时间为1.5h。
[0088] 1.3添加量对蜜蜂巢脾多糖提取的影响
[0089]固定酶解温度50°C，酶解时间1 · 5h，研究木瓜蛋白酶的添加量酶（2 · 4、4 · 8、7 · 2、 9.6、12万U/100g)对提取蜜蜂巢脾多糖的影响。
[0090]图4为酶添加量对提取蜜蜂巢脾多糖的影响曲线图。由图4可以看出，在酶添加量 为2.4、4.8、7.2万U/100g的时候，多糖提取率在稳步增加，而当添加量为9.6万U/100g后，多 糖提取率开始下降。其原因可能是由于木瓜蛋白酶分子已饱和，再增加酶用量，增加的酶分 子也没有机会与底物结合，多糖得率不会有显著增加。因此，选择7.2万U/100g作为木瓜蛋 白酶用量的较优值。
[0091 ] 2酶法提取蜜蜂巢脾多糖的正交实验分析
[0092] 在上述单因素实验的基础上，运用正交表，由水浴温度、水浴时间、酶添加量三因 素做正交实验。
[0093]表1:酶法提取蜜蜂巢脾多糖正交实验结果与分析
[0094]
[0095]
[0096] 正交实验根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代 表性的点具备了〃均匀分散，齐整可比〃的特点。根据表1显示，影响蜜蜂巢脾多糖提取率的 诸因素的主次顺序为A>C>B，即酶添加量 > 水浴时间>提取温度。而采用木瓜蛋白酶法提 取蜜蜂巢脾多糖的最佳工艺为:酶添加量7.2万U/100g，温度50°C，时间1.5h。在此条件下木 瓜蛋白酶提取蜜蜂巢脾多糖的提取率为21.46%。
[0097] 木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，在蜜蜂 巢脾多糖提取过程中可使蜜蜂巢脾中的游离蛋白质发生水解，并进一步水解糖蛋白等结合 蛋白中的蛋白质，减小它们与蜜蜂巢脾中多糖的结合力，有利于蜜蜂巢脾多糖的溶出，同时 也提高了蜜蜂巢脾多糖的纯度，简化了蜜蜂巢脾多糖的提取工艺。
[0098] 本实验采用木瓜蛋白酶提取蜜蜂巢脾多糖，在单因素实验的基础上，设计了三因 素三水平正交实验。综合各种因素及实验结果，得到木瓜蛋白酶提取蜜蜂巢脾多糖的最佳 工艺条件为:料液比为1:15，酶添加量为7.2万U/100g，水浴时间为1.5h，提取温度为50°C， 在此条件下蜜蜂巢脾多糖的提取率为21.46%。
[0099] 以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应 涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种蜜蜂巢脾多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括步骤： 步骤1、将蜜蜂巢脾冷冻后，粉碎、过筛后使用乙醚回流除蜡，除蜡后鼓风烘干，挥发乙 醚，得到巢脾干燥粉末； 步骤2、在巢脾干燥粉末中加入巢脾干燥粉末质量10倍以上的蒸馏水后，加入木瓜蛋白 酶进行酶解得到酶解液;其中，木瓜蛋白酶添加量为每l〇〇g巢脾干燥粉末添加7.2-12万U， 酶解温度为40-60 °C，酶解时间0.5-1.5h; 步骤3、将所述酶解液通过120目纱布过滤，取上清液； 步骤4、在进行步骤3操作后所得的滤渣中，再加入10倍以上的蒸馏水后，加入7.2-12万 U/l〇〇g巢脾干燥粉末的木瓜蛋白酶，重复上述酶解及过滤操作1-2次;将取得的上清液合 并，到蜜蜂巢脾多糖提取液A; 步骤5、将所述蜜蜂巢脾多糖提取液A在80-100°C下进行浓缩l_3h，离心后弃去沉淀得 到蜜蜂巢脾多糖提取液B; 步骤6、往蜜蜂巢脾多糖提取液B中加入占其体积1/4的由氯仿和正丁醇配制成的混合 液，充分抽提20min后，进行4000r-10000r/min的离心操作5-20min，取上清液;其中，在制成 的所述混合液中，氯仿和正丁醇的体积比为4:1;对获取的所述上清液再重复本步骤的操作 3次，获得去蛋白蜜蜂巢脾多糖提取液C; 步骤7、往蜜蜂巢脾多糖提取液C中加入占其体积3-5倍的无水乙醇，在0-26 °C下醇析4-24h后，进行4000r-10000r/min的离心操作10-30min，弃上清液并鼓风干燥挥发干乙醇，得 到蜜蜂巢脾多糖提取物。2. 根据权利要求1所述的蜜蜂巢脾多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述将蜜蜂巢 脾冷冻后，粉碎、过筛后使用乙醚回流除蜡，除蜡后鼓风烘干，挥发乙醚，得到巢脾干燥粉 末，包括： 将西方蜜蜂Apis mellifera L.的三年以上的巢脾，-20°C冷冻4h以上，粉碎后过筛， 巢脾粉使用乙醚回流除蜡，除蜡后鼓风烘干，挥发乙醚，得到巢脾干燥粉末。3. 根据权利要求1所述的蜜蜂巢脾多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述将蜜蜂巢 脾冷冻后，粉碎、过筛后使用乙醚回流除蜡，除蜡后鼓风烘干，挥发乙醚，得到巢脾干燥粉 末，包括： 将西方蜜蜂Apis mellifera L.的三年以上的巢脾，-20°C冷冻4h以上，粉碎后过筛，巢 脾粉使用乙醚回流除蜡； 采用乙醚回流脱脂后使用80%v/v乙醇进行脱脂脱单糖处理； 鼓风烘干，得到巢脾干燥粉末。4. 根据权利要求1所述的蜜蜂巢脾多糖提取物的制备方法，其特征在于，步骤1中的所 述过筛具体为:过50-120目筛。5. 根据权利要求1所述的蜜蜂巢脾多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述在巢脾干 燥粉末中加入巢脾干燥粉末质量10倍以上的蒸馏水后，加入木瓜蛋白酶进行酶解得到酶解 液;其中，木瓜蛋白酶添加量为每l〇〇g巢脾干燥粉末添加7.2-12万U，酶解温度为40-60°C， 加热时间0.5-1.5h，包括： 在巢脾干燥粉末中加入巢脾干燥粉末质量15倍的蒸馏水后，加入食品级的木瓜蛋白酶 进行酶解得到酶解液;其中，木瓜蛋白酶添加量为每l〇〇g巢脾干燥粉末添加9.6万U，酶解温 度为50°C，加热时间1.5h; 所述在进行步骤3操作后所得的滤渣中，再加入10倍以上的蒸馏水后，加入7.2-12万U/ l〇〇g巢脾干燥粉末的木瓜蛋白酶重复上述酶解及过滤操作1-2次，包括： 在进行步骤3操作后所得的滤渣中，再加入15倍的蒸馏水后，加入9.6万U/100g巢脾干 燥粉末的木瓜蛋白酶，重复上述酶解及过滤操作2次。6. 根据权利要求5所述的蜜蜂巢脾多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述往蜜蜂 巢脾多糖提取液C中加入占其体积3-5倍的无水乙醇，在0-26Γ下醇析4-24h后，进行4000r-10000r/min的离心操作10-30min，弃上清液并鼓风干燥挥发干乙醇，得到蜜蜂巢脾多糖，包 括： 往蜜蜂巢脾多糖提取液C中加入占其体积4倍的无水乙醇，在4°C下醇析12h，进行 8000r/min的离心操作20min，弃上清液并鼓风干燥挥发干乙醇，得到蜜蜂巢脾多糖提取物。7. -种根据权利要求1-6任一项所述制备方法获得的蜜蜂巢脾多糖提取物，其特征在 于， 所述蜜蜂巢脾多糖提取物中包括多糖、蛋白质、糖醛酸及单糖，且多糖的含量大于 50% 〇8. 根据权利要求7所述的蜜蜂巢脾多糖提取物，其特征在于:所述蜜蜂巢脾多糖提取物 中，总多糖含量为20-80 %。
【专利摘要】本发明公开一种蜜蜂巢脾多糖提取物及其制备方法，制备方法包括：将蜜蜂巢脾冷冻，粉碎、过筛后使用乙醚回流除蜡，除蜡后鼓风烘干，挥发乙醚得到巢脾干燥粉末；在巢脾干燥粉末中加入蒸馏水及木瓜蛋白酶进行酶解得到酶解液；将酶解液过滤，取上清液；在滤渣中加入蒸馏水及木瓜蛋白酶，重复酶解及过滤1-2次；将上清液合并得到蜜蜂巢脾多糖提取液A；将蜜蜂巢脾多糖提取液A进行浓缩，离心后弃去沉淀得到蜜蜂巢脾多糖提取液B；往蜜蜂巢脾多糖提取液B中加入由氯仿和正丁醇配制成的混合液，抽提后离心，取上清液，获得蜜蜂巢脾多糖提取液C；往蜜蜂巢脾多糖提取液C中加入无水乙醇醇析后离心，弃上清液并干燥挥发干乙醇，得到蜜蜂巢脾多糖提取物。本发明适用于蜜蜂巢脾中多糖的提取。
【IPC分类】C08B37/00
【公开号】CN105646728
【申请号】
【发明人】殷玲, 李冠华, 战旭梅, 刘萍
【申请人】江苏农牧科技职业学院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月11日