并通过超滤或者透析脱酚，再加入乙醇至终浓度为80%，离心后收集沉淀物，沉淀物使用无水乙醇和丙酮洗涤，然后真空干燥得到精制多糖；
[0045](6)多糖衍生
[0046]将精制多糖溶于蒸馏水中至含量为10mg/ml，调节pH值至10.8，温度23°(:下活化反应30min，然后加入酸液至pH为9，然后加入己二酸二酰肼ADH反应6min，己二酸二酰肼ADH的加入量为精制多糖的3.4倍。反应完毕后调节?田直至7.5，并在23°(:下反应151^11后搅拌1211以上，然后透析、过滤、干燥;得到多糖衍生品。
[0047](7)多糖蛋白结合物的制备
[0048]将多糖衍生品与载体蛋白破伤风类毒素蛋白等量混合后调节pH值至5.9，加入等量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC于2°C?8°C反应lh，反应完毕后调节pH值至7，并在4°C、0.2mol/L NaCl溶液中透析12h以上，透析液经过柱层析纯化、浓缩后使用超滤膜除菌，得到B型流感嗜血杆菌荚膜多糖。
[0049]实施例2
[0050]—种B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，包括以下步骤:
[0051 ] (I)发酵培养:用300升发酵罐培养10L菌液，接种初浓度A600 = 0.18，培养pH为7.5、培养温度为36 0C，培养10?15小时，收获细菌浓度A600 >4.00在培养过程中取样进行纯菌试验、涂片革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
[0052](2)灭菌沉淀:当细菌处于对数生长的后期或静止期的前期终止培养，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，然后于培养物中加入适宜浓度的甲醛溶液或脱氧胆酸钠溶液杀菌，以确保杀菌完全及不损伤Hib荚膜多糖为宜。培养液灭菌后高速离心，收集上清液，并在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵CTAB至终含量为0.1 %充分混匀，然后静置再离心，收集沉淀物。十六烷基三甲基溴化铵可以沉淀核算和酸性多聚糖，即本发明的荚膜多糖。
[0053](3)多糖提取和纯化
[0054]在B型流感嗜血杆菌的沉淀物中加入0.6mol/L的氯化钠和等量的氯化锰溶液的混合溶液中使沉淀物浓度达到10mg/ml后解离，解离后在转速6500r/min下离心30min收集上清液;上清液先进行超滤浓缩，浓缩后加入乙醇至乙醇质量分数为20 %沉淀，4°C下静置14h后离心15min去除沉淀，然后离心液中加入无水乙醇至乙醇含量为85%，4°C静置3h后离心，收集沉淀并使用无水乙醇和丙酮洗涤，然后在沉淀中加入水溶解，溶解液再次离心，并将离心液进行透析处理;浓缩得到粗制多糖。本实施例中通过使用氯化钙和氯化锰对沉淀物进行解离，经过检测在相同条件和工艺下实施例1解离后的解离液中核酸含量明显高于本实施例，在加入氯化锰后解离液中核酸含量相比实施例1降低12 %?14 %，未解离的核算保留在沉淀中，使得后续去核酸工艺的纯度更高，含有核酸杂质更低。
[0055]将粗制多糖溶于饱和醋酸钠溶液中，采用酚提法，加入冷酚溶液抽提数次。然后搅拌离心收集上清液，并通过超滤或者透析脱酚，再加入乙醇至终浓度为80%，离心后收集沉淀物，沉淀物使用无水乙醇和丙酮洗涤，然后真空干燥得到精制多糖；
[0056](4)多糖衍生
[0057]将精制多糖溶于蒸馏水中至含量为10mg/ml，调节pH值至10.8，温度23°(:下活化反应30min，然后加入酸液至pH为9，然后加入己二酸二酰肼ADH反应6min，己二酸二酰肼ADH的加入量为精制多糖的3.4倍。反应完毕后调节?田直至7.5，并在23°(:下反应151^11后搅拌1211以上，然后透析、过滤、干燥;得到多糖衍生品。
[0058](5)多糖蛋白结合物的制备
[0059]将多糖衍生品与载体蛋白破伤风类毒素蛋白等量混合后调节pH值至5.9，加入等量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC于2°C?8°C反应lh，反应完毕后调节pH值至7，并在4°C、0.2mol/L NaCl溶液中透析12h以上，透析液经过柱层析纯化、浓缩后使用超滤膜除菌，得到B型流感嗜血杆菌荚膜多糖。
[0060]实施例3
[0061 ] 一种含有B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的联合疫苗包括B型流感嗜血杆菌荚膜多糖、无细胞百日咳疫苗、白喉类毒素疫苗和破伤风类毒素疫苗;其制备方法为:
[0062]包括将无细胞百日咳原液、精制白喉类毒素、精制破伤风类毒素加入氢氧化铝吸附后再加入B型流感嗜血杆菌荚膜多糖原液，然后使用生理盐水稀释，加入硫柳汞至每毫升含有硫柳汞万分之一，调节PH值至5.8，加入1-( 3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC反应I小时；再调节PH至7.0，然后降温至4°(:，最后在0.211101/1 NaCl溶液中透析、超滤浓缩后除菌，于4°C保存。
[0063]实施例4:效力试验
[0064]选取体重为12?14克NIH(或BALb/c)小鼠10只，另取同批小鼠10只作为对照。一组用实施例3制备的疫苗对小鼠进行皮下注射，对照组注射0.85%氯化钠溶液;并于第1、14日皮下注射两次，每次注射剂量为含2.5yg多糖的Hib结合疫苗，于第21?28日经眼眶后静脉采血，以ELISA法测定抗Hib IgG抗体，以0.85%氯化钠溶液对照组小鼠血清的A值求出Cutoff值。检测得知疫苗组有80%以上小鼠的血清抗Hib IgG抗体水平高于Cutoff值，说明本发明的疫苗是具有效力的。
【主权项】
1.一种B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，包括以下步骤: (1)发酵培养:将B型流感嗜血杆菌接种到发酵罐中发酵，并于对数生长的后期或静止期的前期终止培养，获得培养液； (2)灭菌沉淀:将培养液灭菌后高速离心，收集上清液，并在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵充分混匀，然后静置再离心，收集沉淀物； (3)多糖提取和纯化 在B型流感嗜血杆菌的沉淀物中加入氯化钠溶液中解离，解离后离心收集上清液;上清液先进行超滤浓缩，浓缩后加入乙醇至乙醇质量分数为20%，低温静置后离心去除沉淀，然后离心液中加入无水乙醇至乙醇含量为85%，低温静置后离心，收集沉淀并使用无水乙醇和丙酮洗涤，然后在沉淀中加入水溶解，溶解液再次离心，并将离心液进行透析处理;浓缩得到粗制多糖； 将粗制多糖溶于饱和醋酸钠溶液中，加入冷酚溶液抽提数次;然后搅拌离心收集上清液，并通过超滤或者透析脱酚，再加入乙醇至终浓度为60%?80%，离心后收集沉淀物，沉淀物使用无水乙醇和丙酮洗涤，然后真空干燥得到精制多糖； (4)多糖衍生 将精制多糖溶于蒸馏水中调节PH值至10.5?11，温度20°C?26°C下活化，然后加入酸液至PH为9，然后加入己二酸二酰肼ADH反应，反应完毕后调节pH值至弱碱性搅拌12h以上，然后透析、过滤、干燥;得到多糖衍生品； (5)多糖蛋白结合物的制备 将多糖衍生品与载体蛋白混合后调节PH值至5.5?5.9，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC于2°C?8°C反应，反应完毕后调节pH值至6.7?7.1透析，透析液经过柱层析纯化、浓缩后使用超滤膜除菌，得到B型流感嗜血杆菌荚膜多糖。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(I)中用发酵罐培养菌液，接种初浓度A600 = 0.18，培养pH为7.5，培养温度为36°(:，培养时间为1011?1511;收获细菌浓度4600 24.0。3.如权利要求1的方法，其特征在于:所述步骤(2)中十六烷基三甲基溴化铵的终浓度体积分数为0.1 %。4.如权利要求1的方法，其特征在于:所述步骤(3)中氯化钠加入后沉淀物多糖的终浓度为 10mg/ml。5.如权利要求1的方法，其特征在于:所述步骤(3)中加入乙醇至乙醇质量分数为20%，在4°C下静置12h以上后离心去除沉淀。6.如权利要求1的方法，其特征在于:所述步骤(4)中己二酸二酰肼ADH的加入量为精制多糖的3倍?4倍。7.如权利要求1的方法，其特征在于:所述步骤(4)精制多糖的含量为IOmg/1 Oml。8.如权利要求1的方法，其特征在于:所述步骤(5)中载体蛋白为破伤风类毒素蛋白。9.一种含有权利要求1?8中任一所述方法制备得到的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的联合疫苗，其特征在于:所述联合疫苗中包括B型流感嗜血杆菌荚膜多糖、无细胞百日咳疫苗、白喉类毒素疫苗和破伤风类毒素疫苗。10.制备权利要求9所述疫苗的方法，其特征在于:包括将无细胞百日咳原液、精制白喉类毒素、精制破伤风类毒素加入氢氧化铝吸附后再加入B型流感嗜血杆菌荚膜多糖原液，然后使用生理盐水稀释，加入硫柳汞调节PH值至5.8，加入1-( 3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC反应I小时；再调节pH至7.0，然后降温至4°C，最后透析、超滤浓缩后除菌，于4°C保存。
【专利摘要】本发明公开了一种B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，包括发酵培养、灭菌沉淀、多糖提取和纯化、多糖衍生以及多糖蛋白结合物的制备。本发明还公开了将无细胞百日咳原液、精制白喉类毒素、精制破伤风类毒素加入氢氧化铝吸附后再加入B型流感嗜血杆菌荚膜多糖原液，然后使用生理盐水稀释制得多价联合疫苗。本发明公开的制备方法，对现有技术进行了优化，可以获得高纯度、低杂质的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖，同时本发明通过与多组分疫苗组合形成多价疫苗，可以同时对多种疾病进行免疫，减少接种次数，降低医疗风险，可以一次接种获得更好的免疫效果。
【IPC分类】A61K39/10, A61K39/116, A61K39/08, C08B37/00, C12P19/04, A61K39/05, C12R1/02, A61P31/04, A61K39/102
【公开号】CN105646726
【申请号】
【发明人】侯文礼
【申请人】成都康华生物制品有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月3日