一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法及联合疫苗的利记博彩app
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及，具体涉及到一种B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法及联合疫苗。
【背景技术】
[0002]流感嗜血杆菌是常见的致病菌，仅对人类致病，分带荚膜菌株和不带荚膜菌株。荚膜菌株据荚膜多糖的特异性抗原不同分6个血清型(a-f)，其中b型抗原毒力最大，是小儿败血症、脑膜炎和肺炎的主要致病菌。Hib荚膜由脂多糖和荚膜多糖组成，主要成分是核糖基磷酸醇磷酸盐(polyriboylribitolphosphate，PRP)，它的结构包括一个核糖、一个核糖醇以及一个磷酸碱。
[0003]Hib通过飞沫传播，主要感染5岁以下儿童。新生儿通过胎盘传递血清杀菌抗体，从母体获得的。以蛋白质为载体的结合疫苗接种儿童，产生的抗体比单独用荚膜多糖疫苗高得多、且能维持较长时间，这些疫苗的基础是通过PRP多糖与有免疫原性的蛋白载体以共价键结合，使半抗原变成完全抗原，从而使非胸腺依赖抗原(T1-Ag)转变成胸腺依赖抗原(Td-Ag)，促进T细胞对B细胞的作用。T1-Ag仅能激发体液免疫，而Td-Ag不仅能激发体液免疫，而且还能引起细胞免疫，同时产生免疫记忆，通过抗原的转变，不仅使小年龄儿童产生加强免疫反应，而且对再次接种也能产生加强免疫反应，由此提高了疫苗的保护性能。
[0004]为此人们将PRP或其衍生物结合于一种蛋白载体(如白喉类毒素蛋白、以减毒的白喉类毒素蛋白CPM197、破伤风类毒素、脑膜炎奈氏菌外膜蛋白复合物等)上使其转变成T细胞依赖性多糖抗原来增强应答，结合疫苗具有很好的免疫原性。
[0005]近年来，由于抗菌素的滥用，B型流感嗜血杆菌(HoemophiIus influ enzatypeb，Hib)感染已成为导致世界各地幼儿发病和死亡的一个主要原因，每年约有30-50万儿童死于Hib引起的脑膜炎和肺炎等疾病。
[0006]感染性疾病仍然严重威胁着世界人类的健康，尤其是导致婴幼儿发病、住院和死亡的重要原因。随着科技的发展，新疫苗不断地被研究和开发，目前各个国家纳人计划免疫的疫苗种类也日益增多，中国自2008年开始，将免疫规划由原来的5苗防7病扩大为14苗防15病。疫苗种类增多所带来的儿童接种次数增加和疫苗管理负荷增加等，使得研制联合疫苗势在必行。目前国外的很多疫苗供应商和一些国内的疫苗企业都在致力于开发联合疫苗，其中以DTaP为基础的联合疫苗又是当前开发的重点。
[0007]使用Hib疫苗是控制Hib侵袭性疾病的有效措施。Hib疫苗具有较好的免疫原性，接种后可产生良好的免疫应答，可诱发机体产生有效的保护性杀菌抗体。
[0008]预防白喉、破伤风和百日咳三种疾病的DTaP疫苗在中国婴幼儿免疫接种中已广泛使用，预防婴幼儿脑膜炎和肺炎等疾病的Hib结合疫苗已经研制成功并被纳入地方扩大免疫规划中，这两种疫苗免疫程序相同，目前国外已有DTaP-Hib联合疫苗商品问世，但国内尚未研制成功DTaP-Hib联合疫苗。
[0009]目前研制的Hib结合疫苗是安全有效的，在接种3剂后，90%_99%的儿童会产生抗体。因此，WHO建议将Hib疫苗纳入婴幼儿常规免疫规划。另外，该疫苗与无细胞百白破疫苗(DTaP)具有相同的免疫程序，因此，研制无细胞百白破B型流感嗜血杆菌联合疫苗(DTaP/Hib)具有重大意义。联合疫苗开发的目的是在减少疫苗注射次数的同时预防更多种类的疾病。其意义不仅可以提高疫苗覆盖率和接种率、减少多次注射给婴儿和父母所带来身体和心理的痛苦、减少疫苗管理上的困难、降低接种和管理费用;还可减少疫苗生产中必含的防腐剂及佐剂等剂量，减低疫苗的不良反应等。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法及联合疫苗。
[0011]为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，包括以下步骤:
[0012](I)发酵培养:将B型流感嗜血杆菌接种到发酵罐中发酵，并于对数生长的后期或静止期的前期终止培养，获得培养液；
[0013](2)灭菌沉淀:将培养液灭菌后高速离心，收集上清液，并在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵充分混匀，然后静置再离心，收集沉淀物；
[0014](3)多糖提取和纯化
[0015]在B型流感嗜血杆菌的沉淀物中加入氯化钠溶液中解离，解离后离心收集上清液；上清液先进行超滤浓缩，浓缩后加入乙醇至乙醇质量分数为20%，低温静置后离心去除沉淀，然后离心液中加入无水乙醇至乙醇含量为85%，低温静置后离心，收集沉淀并使用无水乙醇和丙酮洗涤，然后在沉淀中加入水溶解，溶解液再次离心，并将离心液进行透析处理；浓缩得到粗制多糖；
[0016]将粗制多糖溶于饱和醋酸钠溶液中，加入冷酚溶液抽提数次;然后搅拌离心收集上清液，并通过超滤或者透析脱酚，再加入乙醇至终浓度为60%?80%，离心后收集沉淀物，沉淀物使用无水乙醇和丙酮洗涤，然后真空干燥得到精制多糖；
[0017](4)多糖衍生
[0018]将精制多糖溶于蒸馏水中调节pH值至10.5?11，温度20 °C?26 °C下活化，然后加入酸液至PH为9，然后加入己二酸二酰肼ADH反应，反应完毕后调节pH值至弱碱性搅拌12h以上，然后透析、过滤、干燥;得到多糖衍生品；
[0019](5)多糖蛋白结合物的制备
[0020]将多糖衍生品与载体蛋白混合后调节pH值至5.5?5.9，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC于2°C?8°C反应，反应完毕后调节pH值至6.7?7.1透析，透析液经过柱层析纯化、浓缩后使用超滤膜除菌，得到B型流感嗜血杆菌荚膜多糖。
[0021 ]优选的，步骤(I)中用发酵罐培养菌液，接种初浓度A600 = 0.18，培养pH为7.5，培养温度为36°C，培养时间为1h?15h;收获细菌浓度A600 2 4.0。
[0022]优选的，步骤(2)中十六烧基三甲基溴化钱的终浓度体积分数为0.1%。
[0023]优选的，步骤(3)中氯化钠加入后沉淀物多糖的终浓度为10mg/ml。
[0024]优选的，步骤(3)中加入乙醇至乙醇质量分数为20%，在4°C下静置12h以上后离心去除沉淀。
[0025]优选的，步骤(4)中己二酸二酰肼ADH的加入量为精制多糖的3倍?4倍。
[0026]优选的，步骤(4)精制多糖的含量为10mg/10ml。
[0027]优选的，步骤(5)中载体蛋白为破伤风类毒素蛋白。
[0028]本发明的另一个目的是公开一种含有B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的联合疫苗，联合疫苗中包括B型流感嗜血杆菌荚膜多糖、无细胞百日咳疫苗、白喉类毒素疫苗和破伤风类毒素疫苗。
[0029]本发明的另一个目的是提供该疫苗的制备方法，包括将无细胞百日咳原液、精制白喉类毒素、精制破伤风类毒素加入氢氧化铝吸附后再加入B型流感嗜血杆菌荚膜多糖原液，然后使用生理盐水稀释，加入硫柳汞调节PH值至5.8，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC反应I小时;再调节pH至7.0，然后降温至4°C，最后透析、超滤浓缩后除菌，于4°C保存。
[0030]综上所述，本发明具有以下优点:
[0031]本发明公开的制备方法，对现有技术进行了优化，可以获得高纯度、低杂质的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖，同时本发明通过与多组分疫苗组合形成多价疫苗，可以同时对多种疾病进行免疫，减少接种次数，降低医疗风险，可以一次接种获得更好的免疫效果。
【具体实施方式】
[0032]实施例1
[0033]—种B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，包括以下步骤:
[0034](I)建立B型流感嗜血杆菌种子批菌种
[0035]采用B型流感嗜血杆菌CMCC58547或CMCC58534菌株，来源于中国药品生物制品检定所。主种子批启开后传代次数不超过5代，工作种子批启开后至接种发酵罐培养传代次数不得超过5代。
[0036](2)制备生产用种子
[0037]启开工作种子批菌种，接种在液体或固体Hib综合培养基上，制备数量适宜的生产用种子。
[0038](3)制备生产用培养基
[0039]采用Hib综合培养基，不得含有对人体有害或其他过敏原物质。
[0040](3)发酵培养:用300升发酵罐培养10L菌液，接种初浓度A600 = 0.18，培养pH为7.5、培养温度为36 0C，培养10?15小时，收获细菌浓度A600 >4.00在培养过程中取样进行纯菌试验、涂片革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
[0041](4)灭菌沉淀:当细菌处于对数生长的后期或静止期的前期终止培养，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，然后于培养物中加入适宜浓度的甲醛溶液或脱氧胆酸钠溶液杀菌，以确保杀菌完全及不损伤Hib荚膜多糖为宜。培养液灭菌后高速离心，收集上清液，并在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵CTAB至终含量为0.1 %充分混匀，然后静置再离心，收集沉淀物。
[0042](5)多糖提取和纯化
[0043]在B型流感嗜血杆菌的沉淀物中加入0.6mol/L的氯化钠溶液中使沉淀物浓度达到10mg/ml后解离，解离后在转速6500r/min下离心30min收集上清液;上清液先进行超滤浓缩，浓缩后加入乙醇至乙醇质量分数为20%沉淀，4°C下静置14h后离心15min去除沉淀，然后离心液中加入无水乙醇至乙醇含量为85%，4°C静置3h后离心，收集沉淀并使用无水乙醇和丙酮洗涤，然后在沉淀中加入水溶解，溶解液再次离心，并将离心液进行透析处理;浓缩得到粗制多糖。
[0044]将粗制多糖溶于饱和醋酸钠溶液中，采用酚提法，加入冷酚溶液抽提数次。然后搅拌离心收集上清液，