[0050] 2)Western Blot鉴定单克隆抗体的特异性
[00511以纯化抗体作为一抗，鉴定其与⑶24的反应，图2显示所得抗体可与市售⑶24-Fc 融合蛋白中CD24部分特异性结合。
[0052] 3)竞争性ELISA测定抗体亲和力
[0053]根据Friguet等测定亲和力的方法，设计抗原竞争结合抗体实验测定亲和常数，固 定抗体浓度为lOpmo 1 · I/1，改变抗原浓度形成一系列反应系统。7个不同浓度的50yL抗原 (0、1·95Χ10-η、3·91Χ10- η、7·81Χ10-η、1·56Χ10-10、3·13Χ10-10、6·25Χ10- 1()mol · L-工） 分别与5(^1^单克隆抗体67^7』4、65、84混合，4°(：过夜反应。将0)24多肽溶解在0.05111〇1· 「 1碳酸缓冲液化119.6)中，终质量浓度为1(^.1111/1，加到96孔板中，每孔10(^，4°(：包被 1511。5%脱脂奶粉封闭2h。分别加入过夜反应的反应液，37°C孵育90min，roST和PBS分别洗3 次。加入1:5000稀释HRP标记的山羊抗鼠抗体。TMB显色液显色，每孔加入lmol · L-hSCkSOy L终止反应，采用双波长法于酶标仪上读取数据，各单克隆抗体"A450nm-A630nm"值。抗原初 始浓度为ao，抗体初始浓度为bo，Ao和Ai分别为初始抗体和结合抗原的抗体的吸收度值。B = (A〇-Ai) /A〇，B为抗体结合率。KD = (1 -B) (a〇-bQB) /B。测出每个反应系统的B值，以B/ (1-B)为 横坐标，（a〇-bo*B)为纵坐标作图（图4)，斜率就是亲和力常数KD。根据线性回归结果，单克隆 抗体 67、厶7』4、65、84亲和力分别为0.811]\1、0.7211]\1、0.8411]\1、0.8211]\1、0.7611]\1。
[0054] 实施例3杂交瘤细胞株67^744、65、84重轻链可变区基因的克隆
[0055] 1.抗⑶24单抗重轻链可变区基因提取、扩增及初步鉴定
[0056] 1)提取总 RNA
[0057]收集对数期杂交瘤细胞，用RNA提取试剂盒(购自生工生物)提取总RNA，溶于20~ 50μ 1无 RNA酶水，-70 °C保存。
[0058] 2)RT-PCR 合成 cDNA 第一链
[0059] 以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链，试剂盒购自生工生物公司，反应按产品说 明书进行。
[0060] 3)PCR扩增轻重链可变区基因
[0061 ]聚合酶为PrimerSTAR高保真聚合酶。所用引物为文献中根据杂交瘤细胞株抗体轻 重链可变区上游及下游基因序列所设计的简并引物，其中轻链VL F(上游引物）和VL B(下 游引物）以及重链VH F1、VH F2和VH B两对引物序列为：
[0062] VL F：gg gag etc gay att gtg mts acm car wet mca；
[0063] VL B：ggt gca tgc gga tac agt tgg tgc age ate；
[0064] VH FI:ett ccg gaa ttc sar gtn mag ctg sag tc
[0065] VH F2:ett ccg gaa ttc sar gtn mag ctg sag tew gg
[0066] VH B:gga aga tet ata gac aga tgg ggg tgt cgt ttt ggc
[0067] (简并密码子说明：r = a，g;y = c，t;m = a，c;s = c，g;w = a，t)
[0068] 反应体积 50μ1，反应条件为：941€5111丨11;941€3〇8,58。(：1111丨11，72。(：1111丨11，循环30次 ； 72°C 10min。取5μ1终产物在100g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。图3显示，PCR扩增获得380bp 左右重轻链基因。用胶回收试剂盒(购自生工生物)对PCR产物进行纯化。
[0069] 4)胶回收DNA产物3'端加腺嘌呤(A)
[0070] 取lyl(5U/yl)rTaq酶，4μ1 dNTP，5yl 10XPCR buffer和40μ1 纯化电泳产物，反应 条件为：94°C，10min，70°C作用40min，4°C，lOmin。
[0071] 5)PCR产物连接至T载体
[0072] 取4·5μ1 PCR产物，0·5μ1 pMD 18-Τ载体，5μ1 ligation buffer solution Ι，16 。(:连接4h。
[0073] 6)连接产物的转化与初步鉴定
[0074]采用CaCl2转化法将连接产物转化至感受态DH5a。具体操作如下：
[0075] A.将200μ1感受态细胞与10μ1 DNA轻轻混合，冰浴30min。
[0076] B.在42°C循环水浴中放置90s，随即将离心管转移至冰浴3min。
[0077] C.每管加入lml无抗性的LB培养基，37°C孵育lh。
[0078] D.离心4000rpm，10min，并重悬于300μ1 LB培养基当中。将300μ1细菌悬液用已无 菌处理的玻璃涂菌棒，均勾涂布于Amp+(100μg/ml)抗性琼脂板上。
[0079] E. 37 °C孵箱培养12h后，观察结果。
[0080] F ·挑取克隆，加入Amp+( 100μg/ml )LB培养基当中振荡过夜。
[0081] G.取ΙμL菌液作为模板，同原PCR步骤进行菌落PCR验证。选取阳性克隆，送由生工 生物测序。
[0082] 2.抗⑶24单克隆抗体轻重链可变区基因测序及分析
[0083]测序结果显示，成功获得五株杂交瘤细胞株抗体可变区基因。利用頂GT-VQUEST数 据库(http://www. imgt.org/)分析抗⑶24单克隆抗体轻重链可变区基因，分析结果表明： A7杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区氨基酸序列及其高变区序列如SEQ ID No. 1~8所示;G7 杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区氨基酸序列及其高变区序列如SEQ ID No.9~16所示;E4 杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区氨基酸序列及其高变区序列如SEQ ID No.17~24所示;G5 杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区氨基酸序列及其高变区序列如SEQ ID No.25~32所示;B4 杂交瘤细胞株抗体重轻链可变区氨基酸序列及其高变区序列如SEQ ID No.33~40所示。
【主权项】
1. 一种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，其重链、轻链可变区中分别包含 SEQ ID No. 10~12和SEQ ID No. 14~16所示CDR1~3区氨基酸序列。2. -种含有如权利要求1所述的可变区序列的抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述 单克隆抗体的结构中包括具有SEQ ID No.9和13所示重链和轻链的氨基酸序列。3. -种基因工程抗体，其特征在于，它所含的重链和轻链可变区序列与权利要求1所述 的可变区序列是一致的；该基因工程抗体包括但不限于:人-鼠嵌合抗体;或者是人源化抗 体;或者是抗体的功能性片段Fab;或者是单链抗体;或者是重链可变区和完整轻链融合的 抗体功能性片段VH-L;或者是重链和轻链的一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体 功能性片段;或者是上述抗体和抗体功能片段和其他各种蛋白或多肽进行连接、拼接、融合 而得到的类抗体的功能性的融合蛋白。4. 一种抗体偶联物，其特征在于，将权利要求2中所述单克隆抗体或者权利要求3所述 的基因工程抗体作为靶向部分，与放射性核素或化学药物或毒素偶联。5. 权利要求2中所述单克隆抗体或者权利要求3所述的基因工程抗体，其特征在于，选 择性地与⑶24结合或抑制⑶24与⑶24配体的结合或中和⑶24。6. 权利要求2所述单克隆抗体或者权利要3所述的基因工程抗体或者权利要求4所述的 抗体偶联物，其特征在于，用于制备治疗与CD24表达异常或过量、失控相关疾病的药物。7. -种抗CD24单克隆抗体制备方法，其特征在于，以CD24核心区多肽所示与血蓝蛋白 KLH偶联物作为抗原。
【专利摘要】本发明公开了一种具有中和人白细胞分化抗原CD24生物活性的单克隆抗体以及该单克隆抗体的可变区序列。本发明以抗原肽与血蓝蛋白偶联物CD24-KLH作为免疫原，免疫注射BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得了可表达抗CD24抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株可用于制备抗CD24单克隆抗体。本发明同时克隆了抗CD24抗体可变区氨基酸序列。本发明的抗CD24抗体可与CD24特异性结合，因此可以用于治疗与CD24表达过量、异常、失控相关的疾病。
【IPC分类】A61K47/48, A61P35/00, C07K16/30, A61K51/10
【公开号】CN105646712
【申请号】
【发明人】张娟, 王旻, 罗晨
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年1月22日