单克隆抗体及其应用
【专利说明】
[00011 本发明是申请号2014100277955,申请日为2014-01-22,发明名称为抗CD24单克隆 抗体、其可变区序列及其应用的分案申请。
技术领域
[0002]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能特异性结合人白细胞分化抗原CD24的 单克隆抗体、其可变区序列及其应用。
【背景技术】
[0003] 人白细胞分化抗原⑶24(cluster of differentiation 24)是一种新近发现并重 点研究的肿瘤标志物。
[0004] 当前研究表明，CD24分子是表观分子量介于30~70kDa之间的高度糖基化唾液酸 糖蛋白。CD24包含33个氨基酸残基组成的核心蛋白骨架结构，具有16个潜在的0-或N-糖基 化位点，与小鼠热稳定抗原高度同源；其成熟多肽能够通过羧基端的磷脂酰肌醇 (glycosyl-phosphatidyl-inositol，GPI)锚定在细胞膜的表面。
[0005] 在生理情况下，CD24分子仅在未成熟B细胞、成熟粒细胞以及少数上皮细胞和神经 细胞上低水平表达;而当机体处于病理状态时，多数恶性肿瘤细胞的表面均能检测到显著 高水平表达的CD24分子，其表达水平的高低与肿瘤的发生和发展密切相关。
[0006] P选择素表达于活化的血小板与内皮细胞表面，⑶24是其配体之一。CD24分子高表 达增强了肿瘤细胞对血小板及内皮细胞的粘附作用，促进了肿瘤的复发与转移。当然，作为 细胞膜表面信号转导分子，CD24能够通过多种作用机制介导肿瘤细胞的的增殖、粘附、转移 和侵袭。研究进一步发现，CD24表达与肝癌细胞的干性紧密相关，CD24可能成为一种新的肝 癌干细胞表面标志物。
[0007] 由此可见，CD24有望成为研究肿瘤发生机制及开发相关诊断试剂的新靶标。
【发明内容】
[0008] 本发明目的一在于提供一种抗⑶24单克隆抗体制备方法。
[0009] 本发明目的二在于提供了一种抗CD24单克隆抗体。
[0010]本发明目的三在于提供抗⑶24单克隆抗体的可变区氨基酸序列。
[0011] 本发明以⑶24核心区多肽与血蓝蛋白KLH偶联物(CD24-KLH)作为免疫原，免疫注 射BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得了可表达抗CD24抗体 的杂交瘤细胞株，此细胞株可用于制备抗CD24单克隆抗体。
[0012] 本发明克隆的抗体重链、轻链可变区氨基酸序列及其高变区如有SEQ ID No. 1~ 16所示。
[0013]本发明的单克隆抗体可与CD24特异性结合。
【附图说明】
[0014] 图1为SDS-PAGE检测Protein G亲和层析柱纯化产物结果。泳道Μ为标准分子量蛋 白；泳道1为腹水样品；泳道2为上样收集液;泳道3为20mM磷酸钠缓冲液洗柱收集液;泳道4 ~6为100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.5)洗脱收集液(每分钟收集lml，共收集3ml)，泳道7~10为 100mM甘氨酸缓冲液(pH 2.7)洗脱收集液(每分钟收集lml，共收集4ml)。
[0015]图2为Western Blot鉴定纯化后抗体与⑶24之间相互作用。泳道Μ为标准分子量蛋 白；泳道1市售⑶24-Fc(购自北京义翘神州）；泳道2为市售Fc(购自北京义翘神州）。
[0016] 图3为PCR扩增抗体重轻链可变区基因琼脂糖电泳结果。泳道Μ为标准分子量DNA; 泳道1为PCR扩增抗体重链可变区基因产物;泳道2为PCR扩增抗体轻链可变区基因产物。
[0017] 图4为竞争性ELISA测定单克隆抗体67、厶7』4、65』4亲和力。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1抗CD24单克隆抗体杂交瘤细胞的制备
[0019] 1.免疫原
[0020]⑶24核心区由33个氨基酸残基组成，其分子量约为3.2kD，免疫原性较弱。本发明 将抗原肽⑶24与血蓝蛋白KLH偶联，以偶联物⑶24-KLH作为免疫原，增强了⑶24核心区多肽 的免疫原性。本发明所用⑶24-KLH由生工生物(上海)有限公司合成，纯度>90%。
[0021] 2.免疫动物
[0022]本发明所用免疫动物为BALB/c小鼠，为SPF级别，由扬州大学比较医学院提供。免 疫佐剂为QuickAntibody，购自北京康碧泉公司。免疫流程参照QuickAntibody说明书进行， [0023] 具体如表1所示。
[0024]表1.免疫途径与周期
[0025]
[0026] 3.细胞融合
[0027] 1)细胞准备
[0028] A.饲养层细胞
[0029]于融合前一天取ICR小鼠（SPF级，购自扬州大学比较医学院）腹腔巨噬细胞，重悬 于HAT培养液(购自GIBC0公司，含有黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷）。接种于96孔 板，置37°C，5%C0 2培养箱中培养24h。
[0030] B.骨髓瘤细胞
[0031] 小鼠骨髓瘤细胞株SP20-Agl4(本实验室保存)不合成和分泌任何一种小鼠免疫球 蛋白重链和轻链，此细胞对8-氮杂鸟嘌呤具有抗性，而在HAT选择性培养基不能生长。融合 前一个星期，用普通的DMEM完全培养基(含15%FBS，购自GIBC0公司）分瓶培养杂交瘤细胞， 以使细胞能生长良好。每一个融合准备250ml生长密度为2Xl0 6cellS/ml处于对数生长中 期的健康细胞。
[0032] C.免疫小鼠脾脏细胞
[0033]处死免疫的小鼠，用酒精浸润后取出脾脏。预先准备好10cm2无菌培养皿，放入细 胞筛网，并加入l〇ml无血清DMEM培养基。把脾脏置于细胞筛网上，并用无菌手术剪将脾脏剪 成碎片。注射器内芯挤压研磨脾脏后，用5ml DMEM不完全培养基冲洗，使细胞通过过筛网进 入50ml离心管中。收集脾脏细胞悬液，用于融合。
[0034] 2)融合
[0035] A.准备20ml无血清的DMEM培养基和lml PEG1450(购自Sigma公司）放于37°C保温。 [0036] B.收集骨髓瘤细胞及脾脏细胞，常温下1500rpm离心5min，用无血清培养基洗两 次，然后将其悬浮于l〇ml无血清培养基中。将5 X 108脾细胞和1 X 108骨髓瘤细胞充分混合， 1500rpm离心5min，弃上清。轻轻敲击管子底部使细胞松散。
[0037] C.取出在37 °C预热的培养基和PEG，把细胞置于37 °C水浴中，lmin内匀速缓慢逐滴 加 lml PEG，加完后及时用无血清的培养基终止。离心弃上清并用50ml HAT培养液重悬细 胞，轻轻混匀。
[0038] D.将细胞加入5块已铺有滋养细胞的96孔板中，每孔100μΙ。置37°C，5%⑶2培养箱 中培养4天。根据细胞生长状态，在筛选前用HAT培养液半换液1~3次，避免孔内培养基变 黄。
[0039] E.融合后7天后，改用含有HT培养液全换液。24h后，吸取细胞培养上清，间接ELISA 检测筛选阳性克隆。
[0040] 3)杂交瘤的单克隆化
[0041] 挑选阳性值较高的克隆孔，采用有限稀释法将孔中的细胞分别稀释至每毫升含5、 10和50个细胞，然后接种于96孔板中，每孔接种10(^1。37°(：、5%⑶ 2湿润培养7~10天，出现 肉眼可见的克隆即可检测细胞培养上清。在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的 孔，取上清作抗体检测。取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。
[0042] 实施例2⑶24特异性抗体的制备和纯化
[0043] 1.腹水收集
[0044]提前一周用0.5ml石蜡油（购自Sigma公司）注射小鼠腹腔。致敏一周后，将生长旺 盛的杂交瘤细胞离心弃去培养基，用PBS或者不完全培养基重悬，调整细胞浓度至2 X 106cellS/ml，注射0.5ml细胞悬液至小鼠腹腔中。7~10天后小鼠腹腔明显肿大，此时采集 腹水。4°C，5000g离心20min，去除腹水中细胞碎片与油脂，然后加入等体积甘油保存于-20 Γ。
[0045] 2.⑶24特异性抗体的纯化
[0046] 采用Protein G亲和层析柱纯化抗体。具体步骤如下：A .用10倍柱体积水清洗 ProteinG亲和层析柱。B.用10倍柱体积20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)冲洗ProteinG亲和层析 柱。C.将所需纯化样品栗入层析柱。D.用100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.5，pH 2.7)洗脱，收集洗 脱峰;并用1M Tris缓冲液(pH 9.0)中和收集物。E.lOmM pH 7.2缓冲液透析脱盐。F.用SDS-pGAGE电泳初步鉴定抗体，图l结果显示50kD及25kD处出现目的条带。
[0047] 3.⑶24特异性抗体的特征分析
[0048] 1)免疫球蛋白亚型鉴定
[0049] 采用武汉三鹰生物技术有限公司的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，鉴定细胞株 G7、A7、E4、G5、B4分泌抗体亚型，结果为：此5株细胞株分泌的免疫球蛋白重链亚型均为 IgGl，轻链亚型均为Kappa。