果见图1的泳道23。
[0088] T3代植株的实时荧光定量PCR鉴定的结果见图2的ck。
[0089] 转空载体植株中不表达GmNAC8基因。
[0090] 三、表型鉴定
[0091 ] 待测种子分别为:8_2株系的T3代种子、转空载体植株的T3代种子、哥伦比亚生态 型拟南芥的种子。
[0092] 1、将待测种子播种于1/2MS固体培养基，于长日照（16h光照/8h黑暗）、22°C条件下 培养10天。
[0093] 2、正常培养
[0094]取步骤1生长状态一致的各株系植株幼苗分别移栽至新的MS固体培养基中培养9 天，观察、拍照并记录各株系植株的表型。
[0095] 3、干旱胁迫培养
[0096]取步骤1生长状态一致的各株系植株幼苗分别移栽至含200mM甘露醇的MS固体培 养基中培养9天，观察、拍照并记录各株系植株的表型。
[0097]进行三次重复试验，每次重复试验中每个株系取35粒种子，结果取平均值。
[0098] 8-2株系植株(用8-2表示)和哥伦比亚生态型拟南芥（用WT表示)完成步骤2时的植 株表型见图3。结果表明，正常条件下培养9天，转基因拟南芥和哥伦比亚生态型拟南芥均生 长状态良好，但转基因拟南芥的叶片比哥伦比亚生态型拟南芥更绿。转空载体拟南芥与哥 伦比亚生态型拟南芥表型一致。
[0099] 8-2株系植株(用8-2表示)和哥伦比亚生态型拟南芥(WT)完成步骤3时的植株表型 见图4。结果表明，干旱胁迫9天后，转基因拟南芥叶片依然鲜绿，而哥伦比亚生态型拟南芥 出现明显叶片萎蔫和黄化，与转基因拟南芥相比哥伦比亚市拟南芥的根系生长显著受到抑 制。转空载体拟南芥的叶片表型与根系表型均与哥伦比亚生态型拟南芥一致。
[0100]以上结果表明，GmNAC8蛋白及其编码基因可提高拟南芥的抗旱能力。
[0101] 实施例4、GmNAC8蛋白在烟草中的功能验证
[0102] -、转基因烟草的获得
[0103] 1、采用叶盘法（参考文献：范媛媛，庞永珍，吴为胜等.双价抗虫植物表达载体 p3300-bt-pta构建及转基因烟草的初步检测.上海交通大学学报.2014,1671-9964.)将无 菌培养的本氏烟叶片与重组农杆菌GV3101/pCXSN-GmNAC8共培养，获得具有潮霉素抗性的 转基因植株(T0)。T0代植株自交，得到T1代植株。T1代植株自交，得到T2代植株。T2代植株自 交，得到T3代植株。
[0104] 2、PCR 鉴定
[0105]提取T0代植株叶片的基因组DNA，使用实施例2中的引物PF1和引物PF2组成的引物 对进行PCR扩增，然后将扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，如果得到约1484bp的扩增产物， 则待测植株为转GmNAC8基因植株。采用重组质粒pCXSN-GmNAC8作为阳性对照。
[0106] PCR鉴定的部分结果如图5的泳道1 -7所示。
[0107] 3、实时荧光定量PCR鉴定
[0108] 提取不同株系(8_ly株系、8_2y株系、8_3y株系、8_6y株系、8_7y株系、8_8y株系、8- 9y株系、8-13y株系、8-16y株系、8-20y株系、8-22y株系等）的T0代植株叶片的总RNA并反转 录获得cDNA，以该cDNA为模板，采用PF3和PR3组成的引物对通过实时荧光定量PCR扩增鉴定 GmNAC8基因的相对表达量（以T-Actin为内参，用于PF5和PR5组成的引物对鉴定内参）。
[0109] PF3:5 '-GTTGGATGACTGGGTTCTATGC-3 '；
[0110] PR3:5 '-TTGTGGCTTGTGGAGGAGG-3 '；
[0111] PF5:5 '-CTCACTGAAGCACCTCTTAACCCG-3 '；
[0112] PR5:5'-CCATCACCAGAATCCAGGACAATA-3'。
[0113] 结果如图6所示，各转基因 GmWNAC8株系中都能检测到GmNAC8基因的表达，其中8-3y株系、8-6y株系和8-8y株系中GmNAC8基因的表达量最高。
[0114] 二、转空载体植株的获得
[0115] 用重组农杆菌GV3101/pCXSN代替重组农杆菌GV3101/pCXSN-GmNAC8,其他同步骤 一，得到转空载体植株。
[0116] T3代植株的PCR鉴定的结果见图5的泳道8。
[0117] T3代植株的实时荧光定量PCR鉴定的结果见图6的ck。
[0118] 转空载体植株中不表达GmNAC8基因。
[0119] 三、表型鉴定
[0120] 待测种子分别为：8_6y株系的T3代种子、转空载体植株的T3代种子、本氏烟的种 子。
[0121] 1、将待测植物的种子播种于蛭石，于长日照（16h光照/8h黑暗）、22°C条件下培养 12天。
[0122] 2、将步骤1得到的幼苗转移至新的蛭石中，正常供水6天，从第7天开始停止供水。
[0123] 步骤2中，正常供水6天时的表型见图7。转基因烟草和本氏烟均生长状况良好，但 转基因烟草的叶片比本氏烟更大、更绿。转空载体烟草与本氏烟表型一致。
[0124] 步骤2中，停止供水6天后的表型见图8。本氏烟叶片明显萎缩并停止生长，转基因 烟草的叶片依然正常伸展仅下部叶片微黄。转空载体烟草与本氏烟表型一致。
[0125] 以上结果表明，GmNACS蛋白及其编码基因可提高烟草的抗旱能力。
【主权项】
1. 一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:将编码GmNACS蛋白的基因导入出发植 物，得到抗旱能力提高的转基因植物； 所述GmNAC8蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质： (a) 由序列表中序列1所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (b) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述"编码GmNACS蛋白的基因"为如下⑴或 (2)或⑶或(4): (1) 其编码区如序列表的序列2自5 '末端第97-1188位核苷酸所示的DNA分子； (2) 序列表中序列2所示的DNA分子； (3) 在严格条件下与（1)或（2)限定的DNA序列杂交且编码具有抗旱功能的蛋白质的DNA 分子； (4) 与（1)或（2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有抗旱功能的蛋白质的 DNA分子。 3. GmNAC8蛋白的应用，为如下(cl)或(c2): (cl)调控植物抗旱能力； (c2)提尚植物抗旱能力； 所述GmNAC8蛋白是如下(a)或(b): (a) 由序列表中序列1所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (b) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。4. 编码GmNAC8蛋白的基因的应用，为如下(cl)或(c2): (cl)调控植物抗旱能力； (c2)提尚植物抗旱能力； 所述编码GmNACS蛋白的基因为如下（1)或(2)或(3)或(4): (1) 其编码区如序列表的序列2自5 '末端第97-1188位核苷酸所示的DNA分子； (2) 序列表中序列2所示的DNA分子； (3) 在严格条件下与（1)或（2)限定的DNA序列杂交且编码具有抗旱功能的蛋白质的DNA 分子； (4) 与（1)或（2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有抗旱功能的蛋白质的 DNA分子。5. 如权利要求1或2所述的方法，或，如权利要求3或4所述的应用，其特征在于:所述植 物为单子叶植物或双子叶植物。6. -种蛋白质，是如下(a)或(b): (a) 由序列表中序列1所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (b) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。7. 编码权利要求6所述蛋白质的基因。8. 如权利要求7所述的基因，其特征在于:所述基因为如下（1)或(2)或(3)或(4): (1) 其编码区如序列表的序列2自5 '末端第97-1188位核苷酸所示的DNA分子； (2) 序列表中序列2所示的DNA分子； (3) 在严格条件下与（1)或（2)限定的DNA序列杂交且编码具有抗旱功能的蛋白质的DNA 分子； (4) 与（1)或（2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有抗旱功能的蛋白质的 DNA分子。9. 含有权利要求7或8所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。10. 权利要求1或2所述方法，或，权利要求6所述蛋白质，或，权利要求7或8所述基因，在 植物育种中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种植物抗旱相关蛋白GmNAC8及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为GmNAC8蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。编码所述GmNAC8蛋白的基因(GmNAC8基因)也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述GmNAC8基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物抗旱能力高于所述目的植物。本发明对于提高植物抗旱能力的育种以及节约农业用水具有重要意义。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/29, C07K14/415, C12N15/82
【公开号】CN105646685
【申请号】
【发明人】方义生, 陈李淼, 周新安, 刘宝红, 张婵娟, 袁松丽, 陈海峰, 杨中路, 张晓娟, 单志慧, 邱德珍, 陈水莲
【申请人】中国农业科学院油料作物研究所
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月15日