一种植物抗旱相关蛋白GmNAC8及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种植物抗旱相关蛋白GmNAC8及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 干旱是世界性问题，全球干旱和半干旱地区的总面积占陆地总面积的34.9%，遍 及50多个国家和地区。我国是世界上干旱和半干旱面积最大的国家，而且面积还在增加，全 球气温每增加1°C，仅黑龙江的干旱面积就会增加10%。对作物的生产来说，造成作物产量 损失的胁迫中有80 %来自于非生物胁迫，其中影响面积最广，造成减产幅度最大的非生物 胁迫就是干旱。干旱对作物的不利影响具有时空（时间和空间）特征，2015年我国北方多省 出现阶段性严重干旱，河北、山东和内蒙古部分地区出现春旱和夏旱。河南、山东、山西等地 发生秋旱。我国平均每年受旱面积2122万公顷，对农业造成的损失相当于其他不良因子造 成损失的总和。干旱会严重限制作物生长造成植株矮小、叶面积缩小、气孔导度下降、叶绿 素含量下降、开花结实受阻等。干旱会造成植物光合产物由源到库的运输途径受阻，也会限 制根系对土壤矿质元素的吸收，对磷的吸收会受到严重抑制，最终导致产量降低和品质变 劣。
[0003] 大豆是我国重要的粮油二用作物。大豆生长过程中，开花期到鼓粒期耗水量最大 占全生育期耗水量的60%-70%，且是大豆的需水临界期，因此干旱对大豆生产有很大影 响。我国的大豆种质资源中就有抗旱的种质，结合分子生物技术途径发现并利用其中的具 有抗旱效应的基因来提升当下主推品种的抗旱能力，是克服干旱对我国大豆生产带来的难 题的有效途径。
[0004] 我国是一个水资源短缺的国家，每年用于农业灌溉的用水量高达用水总量的 65%。提高作物的抗旱能力，是缓解水资源紧张，保障农业长久稳定发展的有效途径，发现 并利用植物抗旱机制的共性，将给农业带来不可估量的价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种植物抗旱相关蛋白GmNACS及其编码基因和应用。
[0000]本发明提供的蛋白质，获自大?，命名为GmNAC8蛋白，是如下(a)或(b):
[0007] (a)由序列表中序列1所不的氣基酸序列组成的蛋白质；
[0008] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0009] 为了使(a)中的GmNACS蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸 序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0010] 表1标签的序列
[0011]
[0012]上述(b)中的GmNACS蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 至lj。上述(b)中的GmNAC8蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所不的DNA序列中缺失一 个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端 和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0013]编码所述GmNAC8蛋白的基因(GmNAC8基因）也属于本发明的保护范围。
[0014]所述基因具体可为如下（1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：
[0015] ⑴其编码区如序列表的序列2自5'末端第97-1188位核苷酸所示的DNA分子；
[0016] (2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017] (3)在严格条件下与⑴或(2)限定的DNA序列杂交且编码具有抗旱功能的蛋白质 的DNA分子；
[0018] (4)与（1)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少 具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至 少具有99%同源性同源性且编码具有抗旱功能的蛋白质的DNA分子。
[0019] 上述严格条件可为50°C，在7%十二烷基硫酸钠（SDS)、0.5M Na3P〇4和ImM EDTA的 混合溶液中杂交，在50 °C，2 X SSC，0.1 % SDS中漂洗;还可为：50 °C，在7 % SDS、0.5M Na3P〇4和 ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50 °C，1 X SSC，0.1 % SDS中漂洗;还可为：50 °C，在7 % SDS、 0.5M Na3P〇4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50 °C，0.5 X SSC，0.1 % SDS中漂洗;还可为：50 。(：，在7 % SDS、0.5M Na3P〇4和 ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50 °C，0.1 X SSC，0.1 % SDS中漂 洗;还可为：50 °C，在7 % SDS、0 · 5M Na3P〇4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65 °C，0 · 1 X SSC， 0.1 % SDS中漂洗；也可为：在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0020] 含有所述GmNAC8基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本 发明的保护范围。
[0021 ]可用现有的植物表达载体构建含有GmNAC8基因的重组表达载体。所述植物表达载 体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源 基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使用GmNACS基因构建重 组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导 型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外，使用GmNACS基因构建重 组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是 ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序 列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是 合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或 植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色 变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从 转基因植物的安全性考虑，也可不加入任何筛选基因，仅通过干旱胁迫进行筛选。
[0022] 所述重组表达载体具体可为将pCXSN载体的两个Xcml位点间插入了序列表的序列 2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
[0023] 本发明还保护所述GmNACS蛋白或其编码基因的应用，为如下(cl)或(c2):
[0024] (cl)调控植物抗旱能力；
[0025] (c2)提高植物抗旱能力；
[0026] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为山柑目植物。所述山 柑目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为南芥族植物。所述南芥族植物可为拟 南芥属植物。所述所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述双 子叶植物还可为茄目植物。所述茄目植物可为茄科植物。所述茄科植物可为夜香树族植物。 所述夜香树族植物可为烟草属植物。所述烟草属植物所述植物具体可为烟草，例如本氏烟。
[0027] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将编码所述GmNACS蛋白的基因导入 出发植物中，得到转基因植物;所述转基因植物抗旱能力高于所述出发植物。
[0028] 所述方法中，所述GmNACS基因可以通过重组表达载体导入目的植物。所述重组表 达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等 常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
[0029] 所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为山柑目植物。所 述山柑目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为南芥族植物。所述南芥族植物可 为拟南芥属植物。所述所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所 述双子叶植物还可为茄目植物。所述茄目植物可为茄科植物。所述茄科植物可为夜香树族 植物。所述夜香树族植物可为烟草属植物。所述烟草属植物所述植物具体可为烟草，例如本 氏烟。
[0030] 本发明还保护所述GmNAC8蛋白、所述GmNAC8基因、所述重组表达载体、所述表达 盒、所述转基因细胞系、所述重组菌或以上任一所述方法在植物育种中的应用。
[0031] 所述育种的目的为培育抗旱能力高的植物。
[0032] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为山柑目植物。所述山 柑目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为南芥族植物。所述南芥族植物可为拟 南芥属植物。所述所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述双 子叶植物还可为茄目植物。所述茄目植物可为茄科植物。所述茄科植物可为夜香树族植物。 所述夜香树族植物可为烟草属植物。所述烟草属植物所述植物具体可为烟草，例如本氏烟。 [0033] 本发明提供了GmNAC8蛋白及其编码基因，将GmNAC8基因导入植物，可以显著提高 植物的抗旱性。本发明对于提高植物抗旱能力的育种以及节约农业用水具有重要意义。
【附图说明】
[0034] 图1为部分T3代植株的PCR鉴定结果;Μ为分子量标准(从上至下的片段大小依次为 500(^口、300(^口、200(^口、100(^口、75(^口、50(^口、25(^口、10(^口），泳道1为哥伦比亚生态型拟 南芥（阴性对照），泳道24为重组质粒pCXSN-GmNAC8(阳性对照）。
[0035] 图2为各个株系中GmNAC8基因的相对表达量。
[0036]图3为8-2株系和哥伦比亚生态型拟南芥正常培养9天的植株表型。
[0037]图4为8-2株系和哥伦比亚生态型拟南芥干旱