ATATTTAATAATAAATCAAATGATATGAAAA 3，。
[0022]利用改良的CTAB法提取水稻叶片基因组DNA作为模版进行基因克隆，将扩增产物连接到PJET1.2克隆载体后送样测序，结果表明基因包含3个内含子，4个外显子。
[0023]实施例三、转基因植株对水稻低氮胁迫下的适应性的作用。
[0024](一)转基因载体的构建。
[0025]设计含有酶切位点的引物以日本晴cDNA为模版，进行编码区的扩增。弓丨物序列如下:
P頂T2-CDS-F:5’ GCCGACATGTGCCTCGCCGCCGCCAT 3’
P頂T2-CDS-R:5，CAAGTAGACTGAGCGTCGAGAT 3，。
[0026]将此片段经过/5Ci和^iEII双酶切后与植物过表达载体PCAMBIA1301进行连接后获得过表达载体MT2-0E。
[0027]通过Blast比对，选取寺异性区域作为目的序列，设计带酶切位点的引物，经过一次PCR两次酶切连接到RNAi植物干扰载体pTCK303，载体构建方法参照文献进行。引物如下:
MT2-kpnI+spe1:5，CGCGGTACCACTAGTGCATCCCGTTCCACCG 3，
MT2-BamHI+sac1:5’ TCAGGATCCGAGCTCAGGCCCTCTGCTACGAAC 3’。
[0028](二)OsP頂T2转基因植株的获得。
[0029]通过农杆菌介导的水稻转化法将上述两个载体导入粳稻日本晴中。过表达转基因植株经过潮霉素历叉基因引物HYGl-F和HYGl-R的PCR鉴定获得阳性的10个克隆186株转基因植株，干扰表达转基因植株经过潮霉素Hyg基因引物HYGl-F和HYGl-R的PCR鉴定，获得8个克隆98株转基因植株，所用引物如下:
HYG1-F: 5 ’ TACTTCTACACAGCCATCGGTCCAG 3，
HYG1-R: 5 ’ AGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTC 3，HYG2-F: 5，TGCTTGACATTGGGGAGTTTAG 3，
HYG2-R: 5，AAGATGTTGGCGACCTCGTATT 3。
[0030]将过表达转基因阳性植株提取DNA进行Southern Blot检测插入基因的拷贝数，选择单拷贝的转基因植株分单株收取种子，然后取100粒以上种子发芽后利用潮霉素进行筛选，若没有死亡则表明转基因植株后代已纯合。
[0031]选择已经纯合的过表达转基因植株种子，干扰表达转基因种子和野生型水稻日本晴种子萌发后，利用Yoshida培养水稻至3叶期，然后提取水稻RNA，以水稻UBC5作为内参基因，进行半定量RT-PCR分析，结果表明，过表达转基因植株中表达上升，而干扰表达转基因植株中表达下降。
[0032](三)转基因植株低氮胁迫下的表型观察。
[0033]为了检验转基因植株在低氮胁迫下的表型，选取三叶期转基因苗用作缺素表达模式的分析。缺素营养液为Yoshida培养基去除相应的元素，缺N素不加ΝΗ4Ν03。处理时间为一周和两周。转基因植株低氮处理以三叶期转基因苗和日本晴苗为野生型，未处理苗种于完全Yoshida营养液(40mg/L氮素)，低氮处理除了含2mg/L氮以外，营养液其它成分不变，处理时间为30天。以上处理进行三个生物学重复。
[0034]转基因材料的分别测定株高与根长，并将采集的数据利用SPSS19.0分析。随后，分别采新鲜的根和茎叶提取粗酶液，在冰上研磨后20000g离心10分钟提取上清即为粗酶提取液成分。粗酶提取液经Ph7.8 50mM磷酸盐缓冲液，10%甘油，2mM抗坏血酸和1% PVP处理分别获得SOD，POD，APX和CAT提取液。蛋白浓度测定使用Bradford法，SOD、CAT、POD和APX分别参照Beauchamp, Aebi,邹琦和Nakano进行测定。粗酶提取液经50mM磷酸盐缓冲液和10%TCA处理获得MDA提取液，利用TBA-MDA反应结合荧光法测定。
[0035]表型观察结果显示:低氮胁迫下水稻秧苗表现出黄化，生长迟缓，叶片老化等表型。从低氮处理I个月后，过表达转基因植株与野生型和RNAi干扰株系相比，转基因植株在株高和长势方面要优于野生型植株和RNAi干扰植株。
[0036]低氮胁迫一个月后，无论是转基因植株或者野生型植株，MDA含量都大大增加。在根中和地上部分，过表达转基因植株中MDA含量普遍低于野生型，尤其是根中的MDA含量显著低于野生型(P〈0.05)，而OsP頂T2 RNAi植株MDA含量比野生型更高。上述结果表明OsP頂T2过表达转基因植株在低氮胁迫下具有更低的脂质过氧化程度。
[0037]0sPIMT2^m因植株的CAT和APX活性不存在显著性差异，但过表达植株地上部分APX的活性略低于野生型，而RNAi转基因植株略高。值得注意的是，
过表达转基因植株POD活性显著下降，而0sPniT2 RNAi转基因植株比野生型也略高。这表明转基因植株在低氮胁迫下，确实会对体内抗氧化系统和氧化产物产生一定的影响。但较低的抗氧化酶并没有导致MDA在过表达转基因植株中增高，因此MDA在对照与转基因植株中的差异可能不是由于过氧化物体系的差异引起的。
[0038]本试验所有数据分析均采用Excel软件对原始数据进行标准化处理，然后用SPSS19.0软件进行统计分析。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种水稻蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或该序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸后功能与SEQ ID NO:3所示序列相同的序列。2.上述水稻OsP頂Τ2蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示；或在严格条件下可与SEQ ID NO:1杂交并且编码上述水稻OsP頂Τ2蛋白的DNA分子；或者与SEQ IDNO:1的序列有90%以上的同源性(优选95%以上同源性)，并且编码上述水稻OsP頂Τ2蛋白的DNA分子。3.上述水稻蛋白的编码基因的cDNA序列，序列如SEQID NO:2所示。4.权利要求2的基因在改善低氮条件适应性的应用。
【专利摘要】本发明涉及植物分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种与低氮胁迫抗逆性有关的水稻蛋白（水稻<i>OsPIMT2</i>）及其编码基因克隆、功能验证与应用。利用Smarter？RACE技术克隆出全长cDNA，进而获得<i>OsPIMT2</i>全长基因组序列。随后构建了<i>OsPIMT2</i>基因的过表达及干扰表达载体，通过农杆菌介导转化粳稻日本晴，通过对转基因植株的低氮胁迫分析表明<i>OsPIMT2</i>基因过表达转基因植株与野生型相比有着更低的脂质过氧化水平和更高的生物量(如干重、株高等)。因此，该基因的表达能使水稻利用有限的氮元素获得产生更高的生物量，为今后培育高氮利用率水稻品种提供一定的理论和基础。
【IPC分类】C12N15/29, C12N15/11, A01H5/00, C07K14/415
【公开号】CN105646682
【申请号】
【发明人】张建福, 谢华安, 魏毅东, 何炜, 许惠滨, 连玲, 蔡秋华, 朱永生, 谢鸿光, 罗曦, 郑燕梅, 吴方喜, 蒋家焕, 林强, 魏林艳
【申请人】张建福, 谢华安, 魏毅东
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年11月12日