一种与低氮胁迫及氮利用相关的水稻基因OsPIMT2的克隆和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种与低氮胁迫应答及氮利用相关的水稻基因(OsPIMW分离克隆、功能验证及应用。
【背景技术】
[0002]氮素是植物生长与发育所必须的大量元素。农作物的生长和粮食生产需要充足的氮素，缺氮所造成的生长和产量的影响是十分常见的。氮缺乏会导致植物生长和生理上剧烈的变化，例如侧根的生长、叶片的黄化、产量的下降、体内活性氧自由基ROS的增加等。因此全球范围内广泛施用氮肥来满足作物的氮需求。然而，过度的使用氮肥虽然会暂时增加作物产量，但是随之而来的经济问题和环境问题也是不容忽视。例如我国农作物每年施用氮肥达到世界氮肥总消耗量的37%，而多余的氮会渗透到地下水或进入到大气中造成严重的环境污染。水稻作为我国最主要的粮食作物之一，也是氮肥投入最多的作物，我国水稻生产中的氮肥消耗占到世界水稻氮肥总消耗的三成。不同水稻品种对于氮素的吸收和利用率各不相同。如何充分挖掘作物遗传潜力，利用不同品种的水稻营养遗传特性的差异，通过筛选和培育氮素高效利用品种来提高氮肥利用率从而达到降低氮肥投入的目标，这也一直以来都是众多生物学家和育种专家所追求的目标。
[0003]高等植物氮代谢过程中，高等植物氮代谢的最初同化是无机态铵离子(NH4+)经过谷氨酰胺合成酶(GS; EC 6.3.1.2)转化为有机态氮谷氨酰胺(Gln)和Gln通过谷氨酸合酶(GOGAT; EC 1.4.1.14，EC 1.4.7.1)转化为两分子的谷氨酸，从而实现无机氮的固定和利用，这个过程称为GS/G0GAT循环，之后形成各种氨基酸参与蛋白质的生物合成。由于GS循环是植物氮代谢上最重要的一个过程，通过GS和GOGAT的基因改造对于植物氮素利用率(Nitrogen Use Efficiency, NUE)的影响并不总是一致的,这可能是由于GS和GOGAT作为体内重要的氮素利用相关基因，其在植物体内的调控是十分复杂的，与许多重要的生理活动有关，例如:维持体内碳氮平衡，光呼吸，不同发育期的氮素分配与利用。各个同源基因都有着独特的功能，对于它们的改动会引起不可预测的影响。目前利用GS/G0GAT相关基因来提高水稻的氮素利用率和低氮胁迫耐受性并没有较大的进展。研究显示那些非初步氮素吸收和利用的酶可能对于提高NUE有极高的潜力，这是由于类似GS等酶具有复杂的转录后和翻译后的调控体系。例如，过表达丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,AlaAT)能够显著提高缺氮情况下转基因水稻的生物量和产量。AlaAT是Ala合成的主要途径，参与体内氮素的储藏，同时还与C4植物的固定碳分子在叶肉和维管束鞘之前的运输有关。之前对于其他植物AlaAT的转基因研究也得出了相似的结果，因此AlaAT对于作物的氮利用率的提高可能有普适性。
[0004]蛋白质的降解和合成总是伴随着能量和营养物质的消化，特别在缺素和新陈代谢较低的条件下，而蛋白质作为体内最重要的生物大分子，含氮量约占16%。蛋白修复异天冬氨酸甲基转移酶(Protein Repair L-1soaspartyl Methy I transferase, PIMT )能直接修复肽链上的异构天冬氨酸(iso-Aspartic acid, isoAsp)与天冬酰胺,使得肽链能够恢复成正常的空间构象，重新激活其生物活性。这种快速而经济的修复蛋白质，能够提高体内资源和能量的利用率。因此PIMT的修复途径对于提高农作物的NUE和缺氮胁迫是否有影响是值得关注的。目前在这方面的研究还没有文献报道，但是其作为NUE相关基因还是值得进一步的探究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种水稻OsPIMT龜因。
[0006]本发明的另一目的在于提供上述水稻0sPIMT2m因编码的蛋白。
[0007]本发明的再一目的在于提供上述水稻OsP頂T2蛋白的编码基因在制备转基因植物中的应用。
[0008]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:通过对转基因植株的低氮胁迫分析表明基因过表达转基因植株与野生型相比有着更低的脂质过氧化水平和更高的生物量(如干重，株高等)。在实际应用中可以将基因转入不同的水稻品种中以培育更加理想的水稻栽培品种，或调节基因的表达获得相应的提高氮利用率的水稻品种。基因及其编码蛋白在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
【附图说明】
[0009]图1过表达和 RNAi 的 PCR 检测。M 为 DNA marker (DL2000)，P 为阳性质粒，N为日本晴阴性对照，其他泳道为转基因植株。
[0010]图2过表达转基因植株的southern杂交检测。Plasmid为质粒阳性对照，WT为阴性对照，T3、T7、T11、T13、T5、T6为0sPIMT2过表达转基因植株。
[0011 ] 图3转基因植株RT-PCR检测。WT为日本晴对照植株，RiMT2-l、RiMT2-2、
RiMT2-3为千扰表达转基因植株，T3、T5、T11为过表达转基因植株。
[0012]图4低氮胁迫一个月后转基因植株的表型观察。NBR为日本晴对照植株，T3、T5、T11为转基因植株，Ri2-3、Ri2-l为千扰表达转基因植株。
[0013]图5低氮胁迫下转基因植株的株高、干重数据统计分析。NBR为日本晴对照植株，T3、T5、Tll为转基因植株，Ri2-3、Ri2_l为千扰表达转基因植株。
[0014]图6低氮胁迫一个月后转基因植株MDA含量(*表示5%显著性水平)。control为日本晴对照植株，T3、T5、Tll为转基因植株，Ri2_3、Ri2_l为0sPIMT2干扰表达转基因植株。
[0015]图7低氮胁迫一个月后转基因植株抗氧化物酶活性(*表示5%显著性水平)。NBR为日本晴对照植株，T3、T5、T11为转基因植株，Ri2-3、Ri2-l为0sPIMT2干扰表达转基因植株。
【具体实施方式】
[0016]下文通过实施例对本发明做进一步说明。
[0017]实施例一、基因全长CDS的克隆。
[0018]通过NCBI数据库，利用拟南芥和小麦的PIMT基因编码区(coding sequence,CDS)序列进行检索,获得高同源性的表达序列标签(expressed sequence tags, ,ESTs),通过序列拼接cDNA序列。根据其保守序列设计引物利用Smarter RACE技术克隆获得全长cDNA，5’ RACE 和 3，RACE 引物如下:
MT2R5:5’ CCCTCTGCTACGAACAATGCTCTGTCAAT 3’
MT2R3:5’ GCAGCGGTTACTTGACAGC 3’。
[0019]首先提取粳稻日本晴的叶片和根的RNA，通过SMARTer ? RACE cDNAAmplificat1n Kit反转录mRNA，分别制备用于含有特异性接头序列的5’ RACE和3’ RACE的cDNA，反转录过程按试剂盒提供的说明书进行。将5’和3’RACE cDNA模版稀释50倍作为RT-PCR模版，以5’ RACE和3’ RACE引物分别与试剂盒提供的通用引物UMP进行PCR扩增，将扩增产物连接到PJET1.2克隆载体后送样测序。
[0020]实施例二、全长基因组序列的克隆。
[0021]通过NCBI数据库，利用已有的全长⑶S与水稻基因组进行比对，确定了 0sPIMT2的开放阅读框，并通过生物信息学软件预测其启动子区，设计了覆盖启动子区，夕卜显子区，内含子区和终止子区的引物序列，引物序列如下:
MT2g-F:5’ GTACAATTCAGTTTTTGTTATTGTTTTATATT 3’
MTIg-R: 5 ’ T