4] 实施例1
[0055] (1)孵化鸡胚:取SPF级受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.5 °C，相对湿度60 %，每2小时自动翻蛋一次，待孵化至16天，取出受精鸡蛋，放-20°C的冷库 中，停止孵化并保存备用。
[0056] (2)匀浆及细胞破碎:对孵化的鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚，在4°C下将 鸡胚用组织匀浆机匀浆后，倒入灭菌后的密封盒中，放到_30°C的冷库中冷冻72小时，融解 后于4°C的环境中对其进行细胞超声破碎，加入等量的注射用水，放置于4°C的冷藏库中备 用。
[0057] (3)酶水解及离心:取细胞破碎后的冷藏液加热水浴至50°C，调pH至7.5，加入胰酶 至浓度为2.5%(质量分数)水解恒温水浴1小时，在4°(：、450(^/1^11条件下离心20分钟，收上 清液在降温至4°C冷藏备用。
[0058] (4)超滤及调PH值:截留具体指使上清液经过50kDa的滤膜，收集分子量50kDa以内 的超滤液;然后使超滤液经过10kDa的滤膜，收集分子量为10kDa~50kDa的部分。调pH值至 6.8~7.2,制得鸡胚多肽。
[0059] 实施例2
[0060] (1)孵化鸡胚：取SPF级受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.5 °C，相对湿度60 %，每2小时自动翻蛋一次，待孵化至14天，取出受精鸡蛋，放-20°C的冷库 中，停止孵化并保存备用。
[0061] (2)匀浆及细胞破碎:对孵化的鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚，在5°C下将 鸡胚用组织匀浆机匀浆后，倒入灭菌后的密封盒中，放到_20°C的冷库中冷冻80小时，融解 后于8°C的环境中对其进行细胞超声破碎，加入等量的注射用水，放置于4°C的冷藏库中备 用。
[0062] (3)酶水解及离心:取细胞破碎后的冷藏液加热水浴至55°C，调pH至7.7，加入胰酶 至浓度为2.5% (质量分数)水解恒温水浴80min，在4°C、4500r/min条件下离心20分钟，收上 清液在降温至4°C冷藏备用。
[0063] (4)超滤及调PH值:截留具体指使上清液经过50kDa的滤膜，收集分子量50kDa以内 的超滤液;然后使超滤液经过10kDa的滤膜，收集分子量为10kDa~50kDa的部分。调pH值至 6.8~7.2,制得鸡胚多肽。
[0064] 实施例3
[0065] (1)孵化鸡胚:取SPF级受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.5 °C，相对湿度60 %，每2小时自动翻蛋一次，待孵化至19天，取出受精鸡蛋，放-20°C的冷库 中，停止孵化并保存备用。
[0066] (2)匀浆及细胞破碎:对孵化的鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚，在4°C下将 鸡胚用组织匀浆机匀浆后，倒入灭菌后的密封盒中，放到_30°C的冷库中冷冻60小时，融解 后于〇°C的环境中对其进行细胞超声破碎，加入等量的注射用水，放置于4°C的冷藏库中备 用。
[0067] (3)酶水解及离心:取细胞破碎后的冷藏液加热水浴至45°C，调pH至7.3，加入胰酶 至浓度为2.5% (质量分数)水解恒温水浴40min，在4°C、4500r/min条件下离心20分钟，收上 清液在降温至4°C冷藏备用。
[0068] (4)超滤及调PH值:截留具体指使上清液经过50kDa的滤膜，收集分子量50kDa以内 的超滤液;然后使超滤液经过lOkDa的滤膜，收集分子量为lOkDa~50kDa的部分。调pH值至 6.8~7.2,制得鸡胚多肽。
[0069] 实施例4
[0070]实施例1制得活性肽经shotgun分析，活性肽的含量为O.1μg/μL;肽段数量共计105 条，分别来自50种不同的蛋白，具体结果如表1:
[0071] 表1 shotgun分析结果
[0072]
[0073]
[0074] 实施例5
[0075] 利用DPPH自由基清除法进行体外实验。鸡胚多肽清除自由基活性的检测：DPPH在 有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，在波长为517nm下具有最大吸收。有自 由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值 下降，且吸光值下降程度与DPPH自由基消除活性呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧 化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越 大，抗氧化性越强。
[0076] 采用DPPH自由基清除法测定鸡胚多肽消除自由基的作用：取DPPH lmg溶于约20mL 95%乙醇中，样品溶于95%乙醇中，配成lmg/mL浓度。在预试过程中，发现加入鸡胚多肽260 yL时颜色基本褪去，则260yL为鸡胚多肽的最大用量。样品用量设为60、110、160、210、260μ Ι^Αο值的测量:取DPPH溶液2mL加入到ΕΡ管中，加95%乙醇lmL，测519nm下的吸光值为A。』值 的测量：取DPPH溶液2mL加入EP管中，分别加鸡胚多肽溶液60、110、160、210、260yL，再用 95%乙醇补齐至1000yL，混合，静置30分钟后，测其吸光值(519nm)为A。
[0077]清除率的计算公式
[0078]结果如图1。结果表明：鸡胚多肽强效清除自由基，0.4~1.73mg/mL范围内具有量 效关系，在1.73mg/mL下其消除效果达约70%。
[0079] 实施例6
[0080] 利用活性氧R0S检测方法。活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种基于荧光染料DCFH-DA的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的最常用 方法。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。进入细胞内，可被细胞内的酯酶水解生 成DCFH。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。绿色荧光强度与活性氧 的水平成正比。在最大激发波长480nm，最大发射波长525nm处，使用焚光显微镜或多功能酶 标仪检测荧光信号。
[0081 ]采用R0S检测试剂盒检测细胞内的R0S含量。将HDF-细胞接种于6孔板内，培养24小 时后，装载探针DCFH-DA( 10M)，37°C细胞培养箱内孵育30分钟。分组为：1)正常对照组;2)阳 性对照组:加终浓度为200M的H2〇 2; 3)实验组分别为，4)、5)、6):分别加入不同浓度的鸡胚多 肽1 〇〇yg/mL，200yg/mL，400yg/mL)。孵育30分钟后，利用200M的H2〇2处理1小时。收集细胞，用 PBS重悬细胞，利用多功能酶标仪(TECAN，GENios)测定这些细胞的荧光值:激发光和发射光 的波长分别为，488nm、525nm〇
[0082] 结果图2。结果表明：100g/mL鸡胚多肽能够高效消除H2〇2产生的自由基，其消除效 率高达77%。
[0083] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种鸡胚多肽，其特征在于，所述鸡胚多肽的分子量为lOkDa~50kDa。2. 权利要求1所述鸡胚多肽的制备方法，其特征在于，包括:将鸡胚去壳、匀浆后，破碎 细胞;经胰酶酶解后，离心收集上清液，超滤截留分子量为lOkDa~50kDa的组分。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述破碎细胞包括冻融和超声破碎的 步骤； 所述冻融的冷冻温度为-20°C~-40°C，时间为60h~80h;溶解温度为4°C~8°C ; 所述超声破碎的4 °C~8 °C，功率为800W~1200W，时间为15min~25min。4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的酶解液中，胰酶的质量分 数为2.5%。5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的温度为45°C~55°C，pH值 为7.3~7.7，酶解时间为40min~80min。6. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述离心的转速为4500转/min，离心 的时间为20min，离心的温度为4°C。7. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述截留后还包括调节pH值为6.8~ 7.2的步骤。8. 权利要求1所述的鸡胚多肽或权利要求2~7任一项所述制备方法制备的鸡胚多肽在 制备抗氧化和/或抗衰老的产品中的应用。9. 一种抗氧化和/或抗衰老的化妆品，其特征在于，包括权利要求1所述的鸡胚多肽或 权利要求2~7任一项所述制备方法制得的鸡胚多肽。10. -种抗氧化和/或抗衰老的保健品，其特征在于，包括权利要求1所述的鸡胚多肽或 权利要求2~7任一项所述制备方法制得的鸡胚多肽。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸡胚多肽及其制备方法与应用。本发明提供的鸡胚多肽的分子量为10kDa～50kDa。本发明提供的鸡胚多肽能够清除自由基，特别是细胞内的自由基，从而起到抗氧化、抗衰老的作用。本发明提供的鸡胚多肽的制备方法操作简便，通过匀浆、冻融和超声破碎，最大程度上的破碎了细胞膜，使胞内的活性肽得到良好的溶出，再经酶解、离心、超滤等生物技术工艺，从而提高了提取效率。
【IPC分类】C07K2/00, A23L33/18, A61K38/00, C12P21/06, A61K8/64, A61Q19/08, A61Q19/00, A61P17/18
【公开号】CN105646647
【申请号】
【发明人】耿威, 金英花, 战铁楠, 耿利, 李杨, 王莉红, 王笑琳, 耿晓宇
【申请人】耿威
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2015年12月30日