一种鸡胚多肽及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸡胚多肽及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产 物。多肽与蛋白质之间并无明显的界限，通常10个以上的氨基酸组成的肽称为多肽，而本发 明的多肽是由完整的生命体提取的多肽，其中含有丰富的细胞因子类多肽。
[0003] 鸡胚即鸡的胚胎，是受精鸡蛋孵化至一定天数后，还未破壳的可食用鸡蛋。研究表 明，鸡胚中包含的营养成分包括蛋白质、多肽、氨基酸、碳水化合物(葡萄糖、果糖、半乳糖、 阿拉伯糖、呋喃糖等）、脂类、脂肪酸等。另外，鸡胚中还包括抗感染成分和生物活性物质。所 述的抗感染成分有球蛋白、干扰素、胎儿蛋白、溶菌酶和磷酸二酯酶;所述的生物活性物质 有唾液酸、儿苯酚胺、胰岛素样生长因子-1、胰岛素、激肽酶、组胺酶、胆碱、红细胞生成素、 脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶等。相对于未孵化的鸡蛋，鸡胚中营养成分，特别是小分子蛋 白或多肽的含量更加丰富，而对人体不理的脂肪、胆固醇等含量则大幅下降。
[0004] 鸡胚营养丰富，具有潜在的护肤、保健和药用价值。但目前对鸡胚中肽的研究目前 还较少，应对其在化妆品、保健品和药品的研究中进行进一步的开发和利用。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种鸡胚多肽及其制备方法与应 用。本发明提供的鸡胚多肽具有良好的清除自由基的效果，能够起到抗氧化、抗衰老的作 用。
[0006] 本发明提供的鸡胚多肽的分子量为1 OkDa~50kDa。
[0007] 本发明制得的鸡胚多肽中，共检测到活性肽105条，分别来自49种不同的蛋白质。 根据PSMs(Peptide_Spectral Match)，这些蛋白质主要为：登录号为E1BTF4的蛋白、 0vomucoid(登录号B6V1G0)、Parvalbumin，thymic(登录号P19753)、登录号为F1NZY2的蛋 白、Histone Η3·2(登录号P84229)、登录号为F1NIU9的蛋白、Polyubiquitin-B(登录号 P0CG62)、Ovalbumin-related protein X(登录号R9TNA6)、Vitellogenin_l(登录号 F1P350)和 Vitellogenin-2(登录号 P02845)。
[0008] 本发明的鸡胚多肽中，鸡胚多肽的浓度为0. lg/yL。
[0009] 本发明提供的鸡胚多肽的制备方法包括:将鸡胚去壳、匀浆后，破碎细胞;经胰酶 酶解后，离心收集上清液，超滤截留分子量为10kDa~50kDa的组分。
[0010]本发明所采用的鸡胚为孵化至14~19天的鸡胚。
[0011] 具体的，鸡胚的获取方式为，取SPF级受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度 控制在37.5°C，相对湿度60%，每2小时自动翻蛋一次，待孵化至14~19天，
[0012] 作为优选，采用孵化至16~17天的鸡胚。
[0013] 受精鸡胚孵化至14天~19天的鸡胚的胚胎处于干细胞高度增长期，各种组织器官 基本形成。在鸡胚的孵化过程中，蛋白质的代谢十分剧烈，孵化期间，蛋白质和多肽的含量 呈持续上升状态。研究表明，在孵化的第14天~19天，鸡胚中蛋白质和多肽的增加幅度最 大，各种细胞因子类多肽最多。
[0014] 制备鸡胚多肽前，孵化鸡胚停止孵化。具体为，将孵化鸡胚放置于-20°C停止孵化。
[0015] 本发明中，所述匀浆采用组织匀浆机。
[0016] 具体为:将孵化至14d~19d的鸡蛋表面消毒，去除蛋壳后以组织匀浆机匀浆。作为 优选，匀浆的温度为4°C，时间为20min转速为2500r/min。
[0017] 经组织匀浆，鸡胚组织粉碎，细胞在匀浆机的机械作用下初步破碎。为了进一步破 碎细胞，进行冻融和超声破碎。
[0018] 在本发明实施例中，破碎细胞包括冻融和超声破碎的步骤；
[0019] 冻融的冷冻温度为-20°c~-40°c，时间为60h~80h;溶解温度为4°C~8°C ;
[0020] 超声破碎的温度为4°C~8°C，功率为800W~1200W，时间为15min~25min。
[0021 ] 在一些实施例中，破碎细胞包括冻融和超声破碎的步骤；
[0022] 冻融的冷冻温度为-30°C，时间为72h;溶解温度为4°C ;
[0023] 超声破碎的温度为4°C，功率为1000W，时间为20min。
[0024] 冻融使细胞在冷冻-融化的过程中，由于细胞内形成冰粒而使剩余胞液的盐浓度 增高而引起细胞破碎。本发明中，溶解的温度为4°C，溶解至细胞匀浆融化。经冻融后，细胞 膜进一步的破裂，再进行超声波破碎，从而使细胞膜的破碎程度更加完全，提高了活性肽的 提取效率。
[0025] 在本发明中，经过超声破碎的组织匀浆与等体积的水混合后，进行酶解。
[0026] 所述酶解指在组织匀浆与胰酶共同孵育，使蛋白质发生分解的过程。
[0027] 本发明中，酶解时胰酶的质量分数为2.5%。即将胰酶加入组织匀浆至质量分数为 2.5%〇
[0028]在本发明中，胰酶的酶活力为37000u/g。
[0029] 在本发明中，酶解的温度为45°C~55 °C，pH值为7.3~7.7，酶解时间为40min~ 80min〇
[0030] 在一些实施例中，酶解的温度为50°C，pH值为7.5，酶解时间为111。
[0031 ]离心后，弃除组织碎片，收集上清液。该上清液中富含蛋白质、活性肽和游离氨基 酸。
[0032] 在本发明的实施例中，离心的转速为4500转/min，离心的时间为20min，离心的温 度为4°C。
[0033] 截留具体指使上清液经过50kDa的滤膜，收集分子量50kDa以内的超滤液;然后使 超滤液经过10kDa的滤膜，收集分子量为10kDa~50kDa的部分。
[0034] 本领域技术人员还可以按照公知的方法对组织匀浆、上清液以及超滤收集的组分 进行冷冻干燥。
[0035] 作为优选，截留后还包括调节pH值为6.8~7.2的步骤。
[0036] 在pH值为6.8~7.2的范围内，鸡胚多肽的性质稳定，活性较高。
[0037] 所述冷冻干燥为鸡胚活性肽与冷冻干燥剂混合，经冷冻干燥制得冻干粉。所述冷 冻干燥剂为甘露醇。具体的，组织匀浆、上清液以及超滤收集的组分中加入甘露醇至质量分 数为15%进行冷冻干燥。优选的，在超滤收集的组分中加入甘露醇至质量分数为15%进行 冷冻干燥。
[0038] DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，实验表明，本发明提供的鸡胚多肽能够 消除自由基，其效果在鸡胚多肽浓度为〇. 4~1.73mg/mL范围内具有量效关系，在1.73mg/mL 下其消除效果达约70%。另外，实验表明，本发明提供的鸡胚多肽能够清除细胞内的R0S， 当鸡胚多肽的浓度为1 〇〇yg/mL时鸡胚多肽能够消除H2〇2产生的自由基，其消除效率高达 77%。研究表明，衰老的原因主要有过度氧化和蛋白质的老化。本发明提供的鸡胚多肽能够 清除自由基，具有抗氧化的作用，从而起到抗衰老的作用。
[0039]因此，本发明提供了：
[0040]鸡胚多肽在制备在制备抗氧化和/或抗衰老的产品中的应用。
[0041 ] -种抗氧化和/或抗衰老的保健品，包括本发明提供的鸡胚多肽。
[0042]本发明提供的保健品的剂型为口服液。
[0043] 口服液中鸡胚多肽的含量为10mg/ml，辅料包括水、甜味剂和香料。
[0044] -种抗氧化和/或抗衰老的化妆品，包括本发明提供的鸡胚多肽。
[0045] 本发明提供的化妆品的剂型为精华液、面膜、膏霜、消炎抗过敏、抗衰乳液等。
[0046] -种化妆品，包括鸡胚多肽、透明质酸、黄原胶、荷荷巴油、熊果苷、甘草酸二钾和 甘油。
[0047]其中，鸡胚多肽的浓度为0.5mg/mL~3.0mg/mL，透明质酸的质量分数为0.3%，黄 原胶质量分数0.3%，荷荷巴油质量分数1 %，熊果苷质量分数0.5%，甘油的质量分数为 3%，甘草酸二钾质量分数为0.1 %，余量为去离子水。
[0048]本发明提供的鸡胚多肽的分子量为10kDa~50kDa。本发明提供的鸡胚多肽能够消 除自由基，其消除效率高达70 %以上。研究表明，衰老的原因主要有过度氧化和蛋白质的老 化。本发明提供的鸡胚多肽能够清除自由基，具有抗氧化的作用，从而起到抗衰老的作用。 本发明提供的鸡胚多肽的制备方法操作简便，通过匀浆、冻融和超声破碎，最大程度上的破 碎了细胞膜，使细胞内的活性肽得到良好的溶出，从而提高了提取效率。
【附图说明】
[0049] 图1示实施例1制得鸡胚多肽胞外去除自由基效果；
[0050] 图2示实施例1制得鸡胚多肽胞内去除自由基效果。
【具体实施方式】
[0051] 本发明提供了一种鸡胚多肽及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本 文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳 实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文的方法和 应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0052]本发明采用的材料、仪器或试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0053]下面结合实施例，进一步阐述本发明：
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