得灵芝粉末30.0 g，按液料比为30:1 (mL/g)加入900mL浓 度为IOmoL/L的盐酸溶液中，在100°C下加热回12h，抽滤得水解液，将所得水解液减压蒸干， 加水15mL溶解浓缩产物，并用氢氧化钠调节pH至3，得粗提液；
[0100] (3)提纯：向步骤(2)所得粗提液中加入1.5g活性炭(活性炭的添加量是灵芝粉末 质量的5%)，在90°C下脱色15min，抽滤除去活性炭，取滤液减压浓缩至初始体积的1/10,有 晶体析出，加入3倍体积量无水乙醇，用氢氧化钠和盐酸调节pH至3,6 °C静置24h，之后在 3000r/min的转速下离心分离15min，除去上层清液，收集沉淀，于70°C烘箱内恒温干燥至恒 重，得到纯化的灵芝氨基酸提取物1.4881g;
[0101] (4)氨基酸含量测定：将步骤（3)所得纯化的灵芝氨基提取物配成4mg/mL的样品 液，通过茚三酮比色法测定氨基酸含量，计算灵芝氨基酸含量。灵芝氨基酸含量=氨基酸含 量/灵芝氨基酸提取物重量X100%。
[0102] 经检测，本实施例所提取的纯化的灵芝氨基酸提取物的灵芝氨基酸含量为 15.44%〇
[0103] 实施例5
[0104] 灵芝氨基酸提取物的降糖活性和抗氧化活性的考察（以实施例2制得的灵芝氨基 酸提取物为测试样品）：
[0105] 为考察本发明的灵芝氨基酸提取物的降糖活性和抗氧化活性，现进行以下实验：
[0106] 1、灵芝氨基酸提取物的降糖活性测定：
[0107] 以PNPG为底物，以96孔板为反应载体，测定灵芝氨基酸提取物对α-葡萄糖苷酶的 抑制率。
[0108] 标准反应体系:将40yL-定浓度的灵芝氨基酸提取物溶液加入20yL 0.2U/mL的α-葡糖糖苷酶溶液中，于37°(：下反应1〇1^11，加入2(^1^6.5111111〇1/1?即6溶液，于37°(：下反应 30min，用120yL 0.2mol/L Na2CO3溶液终止反应，用酶标仪在405nm波长处测定溶液的吸收 值，每个组设置三个平行组。氨基酸浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制率关系见表4。实验组灵芝 氨基酸提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率见图3a;阳性对照组阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑 制率见图3b。
[0109] 样品对酶活性的抑制率（％ ): Inhibition rate( % ) = [ (At)Biank - ABiank) -（Ao - A) ]/(AoBlank - ABlank)
[0110] AoBiank为只加入α-葡糖糖苷酶溶液和PNPG溶液的吸收值;ABiank为只加 PNPG溶液的 吸收值;Ao为加入待测样品溶液，α-葡糖糖苷酶溶液和PNPG溶液的吸收值;A为只加待测样 品溶液和PNPG溶液的吸收值。
[0111]表4:氨基酸浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制率关系
[0113]由上表可知灵芝氨基酸提取物对α-葡糖糖苷酶具有一定的抑制作用，其IC50值为 380.62mg/L〇
[0114] 2、灵芝氨基酸提取物的抗氧化活性测定：
[0115] (1)灵芝氨基酸提取物对DPPH自由基的清除能力
[0116] 以DPPH为底物，以96孔板为反应载体，测定灵芝氨基酸提取物对DPPH自由基的清 除能力。
[0117] 取一定浓度的灵芝氨基酸提取物的溶液0yL、10yL、20yL、30yL、40yL、50yL、60yL、 70yL于96孔板中，无水乙醇补至体积70yL，加 DPPH溶液150yL，以乙醇替代DPPH溶液为空白 对照。充分混合，静置30分钟后，用酶标仪在516nm处测A值，每个组设置三个平行组。氨基酸 浓度与DPPH自由基的清除率关系见表5。实验组灵芝氨基酸提取物对DPPH自由基的清除能 力见图4a;阳性对照组维生素 C对DPPH自由基的清除能力见图4b。
[0118] 自由基清除率的计算公式:清除率=(A0-A)/A0X100%
[0119] 表5:氨基酸浓度与DPPH自由基的清除率关系
[0121] 由上表可知灵芝氨基酸提取物对DPPH具有一定的清除作用，其IC50值为484.54μ g/mL〇
[0122] (2)DPPH的标准曲线的制备
[0123] 取DPPH溶液〇1^、4〇1^、8〇1^、120此、16〇1^、20〇1^于96孔板中，无水乙醇补至体积 200uL，充分混合，用酶标仪在516nm处测吸光度，每个组设置三个平行组。以吸光度(Y)为纵 坐标，以DPPH质量浓度ug/mL(X)为横纵标制作DPPH标准曲线，其线性回归方程为Y = 0.0192X-0.023，R2 = 0.9941。
[0124] (3)添加灵芝氨基酸提取物后DPPH自由基的残留率
[0125] 以乙醇为溶剂，配制不同浓度的灵芝氨基酸提取物样品液，分别取各不同浓度样 品液40uL于96孔板中，无水乙醇补至体积70uL，加 DPPH溶液150uL，以乙醇替代DPPH溶液为 空白对照。充分混合，快速用酶标仪在516nm处测定其不同时间的吸光度值。根据标准曲线 换算成[DPPH·]的质量浓度，从而计算出[DPPH·]残留率。根据[DPPH·]残留率和相应的氨基 酸浓度，绘制出灵芝氨基酸[DPPH·]自由基残留曲线图。实验组不同浓度的灵芝氨基酸提取 物清除DPPH自由基曲线见图5a;阳性对照组不同浓度的维生素 C清除DPPH自由基曲线见图 5b 〇
[0126] [DPPH·]残留率的计算公式：[DPPH· ]rem= [DPPH· ]T/[DPPH· ]τ=〇 X 100%
[0127] 其中[DPPH· ]T为自由基清除过程中某一时刻[DPPH·]的质量浓度，[DPPH· ]τ=ο为 [DPPH·]的原始浓度。
[0128] 由图5a可知灵芝氨基酸提取物对DPPH自由基清除能力与灵芝氨基酸提取物的浓 度呈正相关。
【主权项】
1. 一种灵芝氨基酸提取物，其特征在于，所述的灵芝氨基酸提取物按如下方法制备得 到： (1) 酸水解:取灵芝粉末加入盐酸溶液中，加热回流4~12h，抽滤得水解液，将所得水解 液减压蒸干，剩余物加水溶解，并调节pH至2~4,得粗提液；所述盐酸溶液的浓度为4~ 10m 〇l/L;所述盐酸溶液的体积用量为10~30mL/lg灵芝粉末； (2) 提纯：向步骤（1)所得粗提液中加入活性炭，在50~90°C下脱色15~55min，抽滤除 去活性炭，将滤液减压浓缩后加入无水乙醇，调节pH至2~4，于2~6 °C静置20~24h，之后在 2000~3000r/min的转速下离心分离10~15min，除去上层清液，收集固体沉淀，于50~70°C 烘箱内恒温干燥至恒重，得到所述的灵芝氨基酸提取物。2. 如权利要求1所述的灵芝氨基酸提取物，其特征在于，所述的灵芝粉末是将灵芝置于 60~80°C下烘干至恒重，粉碎至5~10目获得。3. 如权利要求1所述的灵芝氨基酸提取物，其特征在于，步骤（1)中，所述盐酸溶液的浓 度为7.0mol/L，所述盐酸溶液的体积用量为20mL/lg灵芝粉末。4. 如权利要求1所述的灵芝氨基酸提取物，其特征在于，步骤（1)中，所述加热回流的时 间为9.5h。5. 如权利要求1所述的灵芝氨基酸提取物，其特征在于，步骤（1)中，所述的剩余物加6 ~9质量倍的水溶解。6. 如权利要求1所述的灵芝氨基酸提取物，其特征在于，步骤(2)中，所述活性炭的质量 用量为步骤(1)中所述灵芝粉末质量的5%~25%。7. 如权利要求1所述的灵芝氨基酸提取物，其特征在于，步骤(2)中，所述滤液减压浓缩 至初始体积的1 /6~1 /10。8. 如权利要求1所述的灵芝氨基酸提取物，其特征在于，步骤(2)中，在浓缩后的滤液中 加入1~3倍体积量的无水乙醇。9. 如权利要求1所述的灵芝氨基酸提取物，其特征在于，步骤（1)或步骤(2)中，pH的调 节使用氢氧化钠和/或盐酸。10. -种如权利要求1所述的灵芝氨基酸提取物在制备降血糖、抗氧化的保健品及药品 中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种灵芝氨基酸提取物，其按如下方法制备得到：取灵芝粉末，按液料比为10～30：1加入4～10mol/L盐酸溶液中，加热回流4～12h，抽滤得水解液，将其减压蒸干，剩余物加水溶解，并调节pH至2～4，得粗提液；粗提液用活性炭脱色后，滤除活性炭，将滤液减压浓缩后加入无水乙醇，调节pH至2～4，静置后离心分离，收集固体沉淀，干燥至恒重，得到所述的灵芝氨基酸提取物；本发明首次公开灵芝氨基酸的提取工艺，且所得灵芝氨基酸提取物可应用于制备降血糖及抗氧化的保健品和药品等；本发明工艺流程短，方法简单，操作便捷，具有较好的经济效益和社会效益。
【IPC分类】A23L33/175, A61P3/10, A23L33/105, A61K36/074, A61P39/06
【公开号】CN105641001
【申请号】
【发明人】张慧, 姜慧洁, 张晓静, 颜继忠
【申请人】浙江工业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月21日