灵芝氨基酸提取物及其制备方法与用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种灵芝氨基酸提取物及其制备方法，所述灵芝氨基酸提取物可应用 于制备降血糖和抗氧化相关保健品及药品。 (二)
【背景技术】
[0002] 灵芝(Ganoderma Lucidum Karst)为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，是 我国传统的药用真菌，据《神农本草经》记载，灵芝具有补中益气、滋补强壮、扶正固本、延年 益寿等功效，而在《本草纲目》中灵芝亦被列为上品，2000年版《中国药典》中首次承认灵芝 的药用价值，作为我国法定中药材。现代医学证明，灵芝含有多种生理活性物质，包括多糖 类、三萜类、留醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基多肽类、无机元素、脂肪酸等。灵芝能够调 节、增强人体免疫力，对神经衰弱、风湿性关节炎、冠心病、高血压、肝炎、糖尿病、肿瘤等有 良好的协同治疗作用。我国消费者普遍相信灵芝类保健品有抗癌、降糖、提高免疫力等功 效，2014年全国灵芝类保健产品总销售额约20亿元人民币，发展势头较好。
[0003] 灵芝中含有18种氨基酸，其中人体必需氨基酸的相对含量高于50%，比一般食用 菌高40%。相关文献报道了泰山地区的五种灵芝成品的氨基酸含量，除色氨酸被水解破坏 而未检出外，其它17种氨基酸含量丰富，其氨基酸的总含量最高为12.87%，并含有7种人体 必需氨基酸，值得深度开发利用。氨基酸是生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的 生命活动有着密切的关系，是生物体内不可缺少的营养成分之一。人体缺乏任何一种必需 氨基酸，就可导致生理功能异常，影响抗体代谢的正常进行，最后导致疾病。同样，如果人体 内缺乏某些非必需氨基酸，会产生抗体代谢障碍。例如精氨酸和瓜氨酸对形成尿素十分重 要;胱氨酸摄入不足会引起胰岛素减少，血糖升高。目前关于灵芝化学成分分析的研究报道 偏重于多糖及三萜类成分，对灵芝氨基酸及其提取分离的研究报道较少。
[0004] 灵芝化学成分复杂，提取灵芝氨基酸需要优化的条件比较多，所以本发明选择响 应面法。响应面法利用合理的试验设计方法，并通过试验得到一定的数据，采用多元二次回 归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析寻求最优工艺参数，是 解决多变量问题的一种统计方法。响应面的主要优势在于可以减少试验次数，评价多个参 数间的相互作用关系。
[0005] 本发明以灵芝为原料，用盐酸水解法提取灵芝氨基酸，并通过响应面法优化提取 灵芝氨基酸的液料比、提取时间以及盐酸浓度的工艺，并通过活性炭脱色、乙醇沉淀、离心 烘干得到纯化的灵芝氨基酸提取物，为灵芝氨基酸的工业化生产提供价值指导。本发明同 时还发现该灵芝氨基酸提取物具有降糖和抗氧化能力，为灵芝氨基酸在保健品和药品方面 的应用提供科学依据。 (三)
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种灵芝氨基酸提取物及其制备方法，所述的灵芝氨基酸提取物具 有降血糖和抗氧化能力，可应用于制备降血糖和抗氧化相关保健品及药品。
[0007]本发明通过响应面法优化提取灵芝氨基酸的方法，利用design expert软件，根据 Box-Behnken设计原则对液料比、提取时间以及盐酸浓度这些影响灵芝氨基酸提取的因素 进行优化，从而提高灵芝氨基酸的提取率，缩短提取时间，降低能耗和产品成本。
[0008] 本发明采用如下技术方案：
[0009] -种灵芝氨基酸提取物，所述的灵芝氨基酸提取物按如下方法制备得到：
[0010] (1)酸水解：取灵芝粉末，按液料比为10~30:l(mL/g)加入4~10m〇l/L盐酸溶液 中，加热回流4~12h，抽滤得水解液，将所得水解液减压蒸干，剩余物加水溶解，并调节pH至 2~4，得粗提液；
[0011] (2)提纯：向步骤（1)所得粗提液中加入活性炭，在50~90°C下脱色15~55min，抽 滤除去活性炭，将滤液减压浓缩后加入无水乙醇，调节pH至2~4,于2~6°C静置20~24h，之 后在2000~3000r/min的转速下离心分离10~15min，除去上层清液，收集固体沉淀，于50~ 70°C烘箱内恒温干燥至恒重，得到所述的灵芝氨基酸提取物。
[0012]本发明通过响应面法优化提取灵芝氨基酸的方法，利用design expert软件，根据 Box-Behnken设计原则对液料比、提取时间以及盐酸浓度这些影响灵芝氨基酸提取的因素 进行优化，得出所述步骤(1)中，酸水解的最优条件为:液料比为20:1 (mL/g)，盐酸溶液浓度 为7. Omo 1/L，加热回流时间为9.5h。
[0013] 步骤（1)中，所述的灵芝粉末是将灵芝置于60~80°C下烘干至恒重，粉碎至5~10 目获得。
[0014] 步骤(1)中，所述加热回流的温度通常为100~IHTC。
[0015] 步骤(1)中，推荐所述的剩余物加6~9质量倍的水溶解。
[0016] 步骤(2)中，推荐所述活性炭的质量用量为步骤（1)中所述灵芝粉末质量的5%~ 25%，优选15%。所述活性炭脱色的最优条件为:在80°C下脱色45min。
[0017] 步骤(2)中，推荐所述滤液减压浓缩至初始体积的1/6~1/10,可观察到有晶体析 出。推荐在浓缩后的滤液中加入1~3倍体积量的无水乙醇，优选2倍。
[0018] 步骤(1)或步骤(2)中，pH的调节通常使用氢氧化钠和/或盐酸，优选调节pH至3。
[0019] 本发明以PNPG为底物，以96孔板为反应载体，测定所述的灵芝氨基酸提取物对Ct-葡萄糖苷酶的抑制率，实验证明，本发明灵芝氨基酸提取物在制备降血糖保健品及药品方 面具有应用前景。
[0020] 本发明以DPPH为底物，以96孔板为反应载体，测定所述的灵芝氨基酸提取物对 DPPH自由基的清除能力及添加灵芝氨基酸提取物后DPPH自由基的残留率，实验证明，本发 明灵芝氨基酸提取物在制备抗氧化保健品及药品方面同样具有应用前景。
[0021] 本发明突出的有益效果和优点在于：
[0022] 1、本发明采用的Box-Behnken(BBD)中心组合设计模型是响应面法，与正交法相比 该方法可以减少试验次数，同时评价多个参数间的相互作用关系;通过响应面法得到最优 提取条件:液料比为20:1，提取时间为9.5h，盐酸浓度7.0m 〇L/L;最终所得纯化的灵芝氨基 酸提取物其氨基酸含量高达17.78% ;
[0023] 2、本发明首次公开灵芝氨基酸的提取工艺，且所得灵芝氨基酸提取物可应用于制 备降血糖及抗氧化的保健品和药品等;本发明工艺流程短，方法简单，操作便捷，具有较好 的经济效益和社会效益，为灵芝氨基酸的保健品和药品的开发提供了一定的理论和实践依 据。 (四）
【附图说明】
[0024] 图Ia为实施例1中茚三酮比色法测定氨基酸含量的标准曲线图；
[0025] 图Ib为实施例1中液料比对灵芝氨基酸得率的影响图；
[0026] 图Ic为实施例1中提取时间对灵芝氨基酸得率的影响图；
[0027] 图Id为实施例1中盐酸浓度对灵芝氨基酸得率的影响图；
[0028]图2a为实施例1中液料比与提取时间对灵芝氨基酸提取得率影响的响应面三维 图；
[0029]图2b为实施例1中液料比与盐酸浓度对灵芝氨基酸提取得率影响的响应面三维 图；
[0030] 图2c为实施例1中提取时间与盐酸浓度对灵芝氨基酸提取得率影响的响应面三维 图；
[0031] 图3a为实施例5中灵芝氨基酸提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率图；
[0032]图3b为实施例5中阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率图；
[0033]图4a为实施例5中灵芝氨基酸提取物对DPPH自由基的清除能力图；
[0034]图4b为实施例5中维生素C对DPPH自由基的清除能力图；
[0035]图5a为实施例5中不同浓度的灵芝氨基酸提取物清除DPPH自由基曲线图；
[0036]图5b为实施例5中不同浓度的维生素C清除DPPH自由基曲线图。 (五)
【具体实施方式】
[0037] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于 此。
[0038] 实施例1
[0039] 灵芝氨基酸最优提取条件的确定
[0040] -种响应面法优化提取灵芝氨基酸的方法，利用design expert软件，根据Box-Behnken设计原则对液料比、提取时间以及盐酸浓度这些影响灵芝氨基酸提取的因素进行 优化，该方法包括以下步骤：
[0041](一)样品准备
[0042] (1)预处理:将灵芝80.0 g置于60~80 °C下烘干至恒重，粉碎，得灵芝粉末76.4g;
[0043] (2)酸水解：取步骤（1)所得灵芝粉末2.0g，按液料比为10~30 : l(mL/g)加入4~ IOmo 1/L的盐酸溶液中，加热回流4~12h，抽滤，得氨基酸粗提取液；
[0044] (3)调pH:用氢氧化钠溶液调节步骤(2)所得的氨基酸粗提取液的pH至3;