L，NheI酶lyL，EcoRV酶lμL，H2039.5μL，37°C水浴锅3 h。酶切完成后取出2yL样品进行鉴定；
(3)重组慢病毒载体LV-EFla-PSA-2A-GFPWP R E连接、转化、抽提及酶切鉴定连接体系为1yL: T4 DNA ligase 1Xbuffer lyL，载体片段2yL，目的片段6yL，T4 DNA Iigase 1μL，连接过夜。将连接产物取出5yL加入装有感受态细菌(冰水混合状态)Τ0Ρ10的1.5mL EP管中，冰浴30 min，42 °C水浴90 s，冰浴3 min，加入800yL LB液体培养基，30°C，280 r /min振荡培养I h;5 000 r /min离心2 min，弃上清，留200yL吹打混勾后加入氨节抗性的LB固体培养基上，用三角形玻璃棒涂匀，平板放入30 0C恒温箱中培养过夜。挑取饱满的菌落于1:1 000的氨苄LB液体培养基中，30°C，280 r /min，振荡培养12 h。抽提方法参照美国Invitrogen公司质粒抽提试剂盒抽提，完成后取出2yL样品进行鉴定。
[0017]实施例2 CAR-T病毒包装:
采用4质粒系统进行病毒包装，4质粒系统分别表达病毒载体包装所需的gag/pol，Rev，VSV-G，及工程稳定的单链抗体构成的人工嵌合抗原受体。将4质粒按比例进行瞬时转染。总质量为10yg。将上述质粒加入至一定体积的无菌水中，随后加入ΙΟΟμΙ 2.5 mmol /L的
CaC12，向混合液中缓慢滴加2 XHBS溶液500μ1，将上述溶液加入至铺有293T细胞的培养皿中，轻轻混匀，置于37 0C、5%C02培养箱中培养12h，加入含10%FBS的DMEM液体培养基8mL，继续培养48小时。收集转染后48h后的T细胞上清液，于4°C，2000r/min，离心5分钟，除去细胞碎片，用0.45μπι滤器过滤上清液并分装，保存在-70°C。
[0018]实施例3T细胞的分离与扩增培养:
1)原血预处理:抽取患者外周血100ml并加入10yL肝素抗凝剂，然后分装到4个50ml的离心管；用生理盐水I: I对血液进行稀释并用移液管吹打混匀；
2)Ficoll法分离:将稀释后的血液小心加到含有15mlFicoll淋巴细胞分离液的50ml离心管中，每管约35ml，室温2000rpm离心20分钟；
3)T细胞的收集与洗涤:吸取两液面交接处的细胞层到50ml离心管内，用生理盐水补充至30ml混匀，室温2000rpm离心10分钟，待细胞沉淀后洗涤两次；
4)T细胞的扩增培养:将T细胞浓度调整为2X 106个/皿接种到10mm培养皿中，置于370C、5% C02培养箱中培养，待融合至80-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，扩大培养T细胞数为108-109，收集T细胞备用。
[0019]结果如图1所示，经过扩增培养12天后，T细胞扩增比例高于初始T细胞100倍以上，说明了经过上述培养方式，可以在短时间内扩增T细胞;用台盼蓝染色测定T细胞活力，结果如图2所示，细胞活力逐渐提高。
[0020]实施例4CAR-T细胞的转染与制备:
1)将20yg的RetroNectin，包备于6孔板内，置于37°C、5%C02培养箱内培养3h;
2)吸取RetroNectin，利用含2.5%BSA的Hank’s封闭包备后的6孔板，置于37°C、5% C02培养箱内培养Ih;
3)吸取封闭液，利用含2%!fepes的他111^溶液洗涤6孔板。加入含10°/洲5的01^液体培养基，并加入适量的经过包装的病毒溶液，2000r/min，离心5分钟；
4)弃上清，加入2\106的1'细胞，150(^/11^11，离心5分钟。置于37°(:、5%C02培养箱内培养，12h后重复上述步骤。感染5天后进行细胞收集，制备CAR-T细胞，感染后5天测定scFv的表达，通过流式细胞仪检测scFv的表达。结果如图3所示，经过慢病毒感染后的T细胞表面表达高阳性scFv，同时再次培养15天后，其scFv的表达任有91.9%，并未丢失表达。
[0021]实施例5CAR-T细胞对前列腺癌细胞杀伤率检测:
将本发明制备CAR-T细胞作为效应细胞进行杀伤活性测定，实验组靶细胞为PSA表达阳性的前列腺癌细胞PC3，对照组靶细胞为PSA表达阴性的前列腺癌细胞PC3 ο按照效应细胞与靶细胞比例为5:1加入96孔培养板中，在37°C 5%C02培养过夜，采用MTT法测定波长为570nm处吸光度，结果如图3所示。
[0022]结果显示，本发明实验组所制备的CAR-T细胞对PSA表达阳性的前列腺癌细胞PC3的特异性杀伤活性74.9%，显著高于对照组21.4%(P〈0.01)。说明本发明制备的PSA特异性的CAR-T细胞具有杀伤PSA阳性细胞的功能。
【主权项】
1.一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂，其特征在于:由嵌合了靶细胞抗原受体hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G的CAR-T细胞、人血白蛋白、生理盐水按一定比例配制而成，制剂的优选配比为:CAR-T细胞的浓度为(4?6 ) X 1 7个/ml，质量体积比为2%的人血白蛋白，余量为生理盐水。2.根据权利要求1所述CAR-T细胞中CAR为hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G，CAR的具体组成为:由抗人PSA单克隆抗体ant1-PSA轻链和重链可变区hPSAscFv、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内区、以及CD3G胞内信号区串联构成。3.根据权利要求1所述一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法，主要包括以下步骤: (1)载体构建:构建能够表达hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G的载体； (2)转染T细胞的病毒的包装:采用步骤(I)中构建的载体包装慢病毒，获得经过包装的慢病毒； (3)T细胞分离与扩增培养:抽取患者自身血液，从中分离出T细胞并进行扩增培养； (4)Τ细胞的转染与制备:采用步骤(2)中经过包装的慢病毒对步骤(3)中培养所得T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-T细胞； (5)将步骤(4)制备的CAR-T细胞与人血白蛋白按比例混匀，余量用生理盐水补足，制备成CAR-T细胞制剂。4.如权利要求2所述的嵌合抗原受体hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G在制备嵌合抗原受体T细胞及其在前列腺癌治疗药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂及其制备方法，本发明的制剂由CAR-T细胞、人血白蛋白、生理盐水按一定比例配制而成。本发明所制备嵌合抗原受体（CAR）是hPSAscFv-CD8-CD28-CD3ζ，该嵌合抗原受体由抗人PSA单克隆抗体anti-PSA轻链和重链可变区（hPSAscFv）、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内区、以及CD3ζ胞内信号区串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞（CAR-T细胞）用来治疗PSA阳性的前列腺癌，治疗效果显著，从根本上提供了一种治疗前列腺癌的方法。
【IPC分类】A61K35/17, C12N15/867, A61P35/00
【公开号】CN105640991
【申请号】
【发明人】周萱
【申请人】奥思达干细胞有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月6日