一种治疗前列腺癌的car-t细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]嵌合抗原受体是模拟T细胞受体功能的人工受体，由抗原识别结构域(配体或单链抗体)和T细胞的一系列信号结构域依次连接而成。利用嵌合抗原受体修饰T细胞能够将配体或抗体的特异识别作用与T细胞的效应功能联合起来，进行肿瘤靶向免疫治疗。此疗法是对人体自身T细胞加以改造后用于治疗，相对于放和化疗，其毒副作用较弱。由于嵌合抗原受体修的T细胞通过其抗原识别结构域识别肿瘤细胞表面抗原，然后启动杀伤作用，因此其治疗具有靶向性。由于该种T细胞通过其嵌合抗原受体直接识别肿瘤细胞表面抗原，然后通过其信号结构域直接将识别信号传速至胞内，激活T细胞的杀伤活性，因此可以绕开常规细胞免疫的主要组织相容复合体(MHC)限制性，从而有效克服肿瘤细胞MHC表达量低造成的免疫逃逸，并可以靶向非蛋白质肿瘤抗原。
[0003]前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是常见男性泌尿系统恶性肿瘤，其死亡率已超过肺癌，成为严重威胁男性健康第二大恶性肿瘤。虽然早期PCa易治疗，生产率高，但是三期、四期PCa死亡率高，且易出现骨转移。PCa目前的治疗方式主要有手术，放疗和化疗。PCa切除术手术创伤大、术后尿失禁和勃起功能障碍的发生率极高，且手术死亡率亦高;而放疗和化疗带来的副作用大，会严重影响患者的生活质量。
[0004]PSA是一种含有237个氨基酸的单链多肽，具有组织特异性，只存在于人前列腺腺泡及导管上皮细胞胞浆中，不表达于其它细胞，血清PSA是前列腺癌的特异性标志物，而在正常细胞不表达。因此，PSA是前列腺癌靶向治疗的潜在位点。国外已有报道抗CD19-CAR-T细胞在B细胞肿瘤中的应用取得了良好的治疗效果，因此利用抗PSA-CAR-T细胞构建的嵌合抗原受体hPSAscFV-CD8-CD28-CD3G表达于T细胞表面，使T细胞特异性杀伤PSA阳性的肿癌细胞，提高前列腺癌的治疗效果和晚期前列腺癌症患者的生存率，为前列腺癌患者的临床治疗提供一种新的方法。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，提供一种新的有效的前列腺癌治疗方法，利用抗PSAscFv构建出的抗PSA嵌合抗原受体(hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G)，表达该嵌合抗原受体的CAR-T细胞也具有其独特性，初步研究其肿瘤特异性杀伤功能，以进一步探讨其在临床治疗中的应用。
[0006]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂，由嵌合了靶细胞抗原受体hPSAscFV-CD8-CD28-
⑶3ζ的CAR-T细胞、人血白蛋白、生理盐水按一定比例配制而成。制剂的优选配比为:CAR-T细胞的浓度为(4?6) X 107个/ml，质量体积比为2%的人血白蛋白，余量为生理盐水。
[0007]进一步的，所述CAR-T细胞中CAR为hPSAscFv-CD8 -CD28_CD3G，具体组成为:由抗人PSA单克隆抗体ant1-PSA轻链和重链可变区hPSAscFv、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内区、以及CD3G胞内信号区串联构成；
进一步的，所述CAR-T细胞的靶细胞抗原为PSA。
[0008]进一步的，所述CAR-T细胞由一种表达载体所表达，其中，表达载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒的一种，优选慢病毒。
[0009]—种治疗前列腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法，主要包括以下步骤:
(1)载体构建:构建能够表达hPSAscFv-CD8-CD28-CD3G的载体；
(2)转染T细胞的病毒的包装:采用步骤(I)中构建的载体包装慢病毒，获得经过包装的慢病毒；
(3)T细胞分离与扩增培养:抽取患者自身血液，从中分离出T细胞并进行扩增培养；
(4 )Τ细胞的转染与制备:采用步骤(2 )中经过包装的慢病毒对步骤(3 )中培养所得T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-T细胞；
(5)将步骤(4)制备的CAR-T细胞与人血白蛋白按比例混匀，余量用生理盐水补足，制备成CAR-T细胞制剂。
[0010]本发明相对于现有技术具有以下优点和效果:
(1)本发明首次将嵌合了前列腺癌细胞抗原受体的CAR-T细胞，用来治疗前列腺癌，治疗效果显著，从根本上提供了一种治疗前列腺癌的方法；
(2)本发明首次将嵌合了前列腺癌细胞抗原受体的CAR-T细胞与人血白蛋白联合制作成一种靶向治疗前列腺癌的免疫细胞制剂，人血白蛋白可以维持CAR-T细胞的活性。本制剂成分明确，制作简便，为CAR-T细胞的临床推广应用提供了更便捷的方法；
(3 )本发明所选用的靶细胞抗原为PSA: PSA是前列腺癌的最重要的特异性标志物。70-80%的前列腺癌病人在发病期间都有PSA基因高表达的特征，PSA几乎表达于所有的前列腺癌细胞表面，而在其他细胞表面几乎不表达，在临床上被认为是前列腺癌的经典肿瘤标记物。因此采用PSA作为靶细胞抗原可以大大提高使CAR-T细胞特异性识别和杀伤前列腺癌细胞的能力，降低前列腺癌患者的复发和提高治疗效果；
(4)本发明采用的是第三代CAR，第三代CAR的重组T细胞能够增加γ-干扰素和抗细胞凋亡蛋白的分泌，在抗肿瘤活性、存活周期及细胞因子释放方面均显著提高。
[0011]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施案例并配合附图详细说明如后。本发明的【具体实施方式】由以下实施例及其附图详细给出。
【附图说明】
[0012]图1表示从患者外周血分离得到的T细胞体外培养扩增曲线。
[0013]图2体外培养扩增所得T细胞的活力测定。
[0014]图3显示用不同MOI值的慢病毒感染T细胞的感染效率(用FITC-标记的蛋白检测s cFv在T细胞上的表达率)。
[0015]图4显示CAR-T细胞对PSA表达阳性的前列腺癌细胞PC3的特异性杀伤率。
【具体实施方式】
[0016]实施例1 CAR-T细胞表达载体构建:
(1)PCR扩增目的片段抗PSA抗体以pCDNA3-scBW431/26-hFc质粒为模板设计引物，在其5 ’、3 ’端分别加上Nhe1、Sal I限制性内切酶位点，CEA Up NheI上游引物5 ’ -AGG CTAGCATGGGATAGGAG CTG TATCAT-3 ' , PSA-HER2 Dn SalI 下游引物 5'-AGGTCGACGGTATCGAATAAGCTTTG-3 ’，反应条件95 °C 预变性5min ,95 °C 变性 I Os，68 °C 退火 15s，72°C延伸30 s，30个循环，扩增完成后取出2yL样品进行鉴定；
(2)双酶切LV-EFla-Luciferase-PGK-FP635-WPRE载体、目的片段PSA--CD3-2A-GFP载体酶切体系为50yL: 10 XGreen buffer 5yL，载体3yL，NheI酶lyL，SalI酶lyL，H20 40yL；目的片段酶切体系为50yL: 10 XGreen buffer 5yL，目的片段回收产物2.5y