其在人群中发生的概率较低。 SLC26A4 基因是 Pendred 综合征（Pendred syndrome ;0ΜΙΜ 号：#274600)和常染色体隐性 耳聋伴前庭导水管扩大症（Deafness, autosomal recessive 4,withenlarged vestibular aqueduct;0M顶号：#600791)的致病基因，均为常染色体隐性遗传。在其GJB2基因编码 区（EX2/CDS1)发现1个错义突变c. 109G>A(p.Val37Ile)，为杂合子；已有相关文献报道 其致病性。GJB2 为常染色体隐性耳聋 IA 型（Deafness, Autosomal Recessive 1A，OMIM : #220290)和常染色体显性耳聋 3A 型（Deafness, Autosomal Dominant 3A，OMIM :#601544) 的致病基因。在非综合征型耳聋相关基因上还发现多个剪切、错义或同义变异。因此，推测 SLC26A4基因的剪切突变c. 919-2T>C和GJB2基因的错义突变c. 109G>A (p. Val37Ile)为耳 聋病人的可疑致病性突变。
[0117] 对其中SLC26A4基因的c. 919-2T>C突变用金标准Sanger法进行验证，发现与本 发明检测到的突变类型完全一致（如图3所示）。同理，GJB2基因 Sanger测序结果，箭头示 c. 109G>A(p. Val37Ile)杂合突变。与本发明检测到的突变类型完全一致（如图4所示）。
[0118] 以上结果显示，利用本发明的方法可以基于二代测序平台进行遗传代谢病致病突 变的检测，结果准确有效，为医生进一步对遗传代谢病患者进行针对性的治疗提供有力的 理论指导。
[0119] 备注说明数据库已告知了与疾病相关的已报道的突变基因位点信息。
[0120] 经过二代测序的分析，我们只发现GJB2基因和SLC26A4基因存在已被证实的致病 突变，其他基因的突变都是非致病突变，因此只需要对致病突变位点进行一代测序法的验 证艮阿。
[0121] 实施例2 :参考实例1的方法，对某葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症病人，利用本发 明的方法设计引物，第一轮引物序列如下表2 :
[0122] 表2、G6H)基因第一轮PCR引物序列表
CN 105177160 A 说明书 21/24 页
[0125] 第一轮PCR完成后，进行第二轮PCR后高通量测序（具体步骤和方法见实例I)，得 到的结果如下：
[0126] G6H)缺乏症患者的高通量测序结果为：
[0128] 对其中G6H)基因的c. 678C>G突变位点用金标准Sanger法进行验证（以正常人 为对照），发现与本发明检测到的突变类型完全一致，如图5所示：
[0129] 图5是G6H)基因的Sanger测序结果。上图为正常人的反向序列（野生型），下图 为患者样本反向测序结果，箭头处为c. 678C>G的纯合突变。
[0130] 未发现该患者在产品检测范围内存在其他已知或疑似致病性突变。结合疾病的发 病率、位点在各数据库中的频率及受检者临床主述，检出1个临床意义未明位点。临床意义 未明位点不足以解释疾病的发生，仅作为医生参考。
[0131]位点详情：G6PD ;NM_000402 ;c. 678C>G ;ρ· Ile226Met ;CDS6 错义突变，暂 无该位点致病性的相关文献报道，临床意义未明。该位点在人群中发生频率极低。经SIFT 和Polyphen对其进行蛋白功能预测，结果均为有害。
[0132] 以上结果显示，利用本发明的方法可以检测出Gero基因的有害突变位点，为医生 进一步对遗传代谢病患者进行针对性的治疗提供有力的理论指导。
[0133] 实例3 :参考实例1的方法，对某Gitelman综合征病人的新生儿，利用本发明的方 法对相关致病基因 SLC12A3基因设计引物（第一轮PCR的引物如表3)进行PCR扩增后高 通量测序，判断该病人的儿子是否患Gitelman综合征，得到以下结果：
[0134] 表3、SLC12A3基因第一轮PCR引物序列表
CN 105177160 A 说明书 23/24 页
[0137] Gitelman综合征患者的新生儿的高通量测序结果为：
[0139] 对其中SLC12A3基因的C. 176_179delACAAA缺失突变位点用金标准Sanger法进 行验证，发现与本发明检测到的突变类型完全一致，缺失了 ACAAA序列后，造成了移码突 变，同时为杂合子，造成后续的双峰（箭头指示处开始发生移码），如图6所示。
[0140] 图6为SLC12A3基因的Sanger测序结果。上图为正常人序列（野生型），下图为 患者样本测序结果，箭头处为移码突变起始处，基因型为杂合性缺失。
[0141] 该C. 176_179delACAAA缺失在dbSNP等数据库中均未出现，为新的缺失突变，该缺 失导致后续的氨基酸移码，而该突变为杂合性缺失，对该常染色体隐性病来说，该新生儿为 致病基因携带者。本结果可以做为医生临床参考。
[0142] 结果显示，本发明的探针可用于新一代测序，检测遗传代谢病患者的突变位点，为 医生进一步对遗传代谢病患者进行针对性治疗提供理论指导。
[0143] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例，本发明不限于 以上实施例，还可以有许多种变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接 导出或者联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 用于新生儿遗传代谢疾病基因体外定性检测的引物的设计方式，其特征是包括如下 步骤： 1) 、获得遗传病相关的致病基因信息： 通过OM頂数据库获得多种遗传性疾病相关的致病基因信息，包括基因位置信息、突变 位点信息，然后根据得到的基因信息从NCBI数据库得到相关基因的外显子及内含子信息； 2) 、针对相关基因设计引物： 对于每个基因的外显子及外显子内含子结合区域设计对应的特异性引物Fl和R1，设 计原则为：每个外显子外延5bp，以保证将外显子内含子结合区域包含在内；引物序列区保 守，即不存在突变或SNP，Tm值均一，Tm值的差异在5°C之内；扩增产物至少有IObp的重叠 区；在每对引物前加上一段自行设计的序列Al和A2以及一段6个碱基的识别序列，用以二 代测序结果的识别； Al和A2的序列如下： Al(5' -3' ） ：TCTTTCCCTACCGACGCTCTTCCGATCT A2(5' -3' ） ：GTGACTGGAGTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 识别序列有 12 个，分别为 ATCACG，TTAGGC，ACAGTG，TGACCA，GCCAAT，CAGATC，ACTTGA， ATCACG，TAGCTT，GGCTAC，CTTGTA，GATCAG，每段识别序列可随机加到Fl和Rl中，Fl和Rl中 识别序列的组合方式可以作为测序结果中样品和基因的识别信号。2. 用于新生儿遗传代谢疾病基因体外定性检测的引物，其特征是：如表1~表3中的 至少1个表格所述； 综合征型耳聋的第一轮PCR引物序列表如下表1 ;G6ro基因的第一轮PCR引物序列表 如下表2 ;SLC12A3基因第一轮PCR引物序列表如下表3 ; 表1：q3. 试剂盒，其特征是：该试剂盒含有如权利要求2所述的引物，该试剂盒能同时检测多 种新生儿遗传病。4. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是： 可以用于检测苯丙酮尿症、精氨酸血症、精氨基琥珀酸尿症、瓜氨酸血症I型、瓜氨酸 血症II型、楓糖尿症、酪氨酸血症I型、酪氨酸血症II型、酪氨酸血症III型、鸟氨酸氨甲 酰基转移酶缺乏症、半乳糖血症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、异戊酸血症、丙酸血症、戊 二酸血症I型、肉碱转运障碍、肉碱棕榈酰转移酶I缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶II缺乏症、 遗传性非综合征耳聋、Gitelman综合征这22种常见新生儿遗传病相关的基因。
【专利摘要】本发明公开了一种用于新生儿遗传代谢疾病基因体外定性检测的引物的设计方式，包括如下步骤：1)、获得遗传病相关的致病基因信息：通过OMIM数据库获得多种遗传性疾病相关的致病基因信息，包括基因位置信息、突变位点信息，然后根据得到的基因信息从NCBI数据库得到相关基因的外显子及内含子信息；2)、针对相关基因设计引物：对于每个基因的外显子及外显子内含子结合区域设计对应的特异性引物F1和R1。本发明还同时公开了综合征型耳聋的第一轮PCR引物序列表、G6PD基因的第一轮PCR引物序列表、SLC12A3基因第一轮PCR引物序列表。本发明能用于检测22种常见新生儿遗传病相关的基因。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105177160
【申请号】
【发明人】谭海芹, 余文菁, 洪旭涛, 宓娅娜
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月16日