] 本发明具有如下优势与创新点：
[0054] 1.优势：疾病基因突变位置不是固定的，因此无法用taqman探针法进行检测，必 须用测序法。目前，一代测序每次只能检测500 - 1000 bp长度，基因如果达到几百kb，检测 会变的非常昂贵，且检测花费时间很长。直接利用全基因组二代测序或者全外显子测序，则 成本过高，同时大量无用的测序结果，也会使分析变的非常困难。本发明只针对某些遗传代 谢病的致病基因外显子和外显子内含子结合区进行扩增子测序，大大简化了检测程序，并 使后续分析更简单，能够快速地得到结果。
[0055] 2.创新点：本发明只需要进行两次PCR扩增，就可以将相关基因的外显子区域扩 增出来，其产物可以直接用于二代测序，对于该过程中的第一次PCR扩增的引物设计跟普 通的PCR引物相比，在目标片段的引物前端增加了一段特殊的序列和一段6碱基的标识序 列，具有创新性；另外本发明首次对基因的不同转录本的外显子区域进行合并，将合并后 的外显子集合作为该基因外显子的模板进行引物设计，更全面的覆盖了该基因的外显子区 域，能够更多的发现外显子区域的突变位点，使得结果更全面、更可信。
[0056] 备注说明：如果去除本发明所述的"标识序列"会导致在无数的测序序列中无法识 别出本发明所需要的序列；即，无法实现本发明。
【附图说明】
[0057] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0058] 图1为目的基因外显子扩增原理图；
[0059] 图2为某基因 3个转录本的外显子集合方式示意图。
[0060] 图3是SLC26A4基因 Sanger测序结果；箭头示c. 919-2T>C纯合突变。
[0061] 图3中，上图为标准序列（野生型），下图为患者样本测序结果，箭头表示纯合突 变。
[0062] 图4是GJB2基因 Sanger测序结果；箭头示c. 109G>A(p. Val37Ile)杂合突变。
[0063] 图4中，上图为标准序列（野生型），下图为患者样本测序结果，箭头表示杂合突 变。
[0064] 图5是G6H)基因的Sanger测序结果。上图为正常人的反向序列（野生型），下图 为患者样本反向测序结果，箭头处为c. 678C>G的纯合突变。
[0065] 图6是SLC12A3基因的Sanger测序结果。上图为正常人序列（野生型），下图为 患者样本测序结果，箭头处为移码突变起始处，基因型为杂合性缺失。
【具体实施方式】
[0066] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0067] 实施例1 :本实施例选取了非综合征型耳聋相关致病基因 GJB2、GJB3、SLC26A4、 12SrRNA、COCH和DFNA5共六个基因，
[0068] 一、样本准备（测序文库的获得）
[0069] 对该基因的外显子及外显子内含子结合区进行两轮PCR扩增获得测序文库的步 骤如下：
[0070] 1.致病基因信息的获得。
[0071] 在 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)网站或 NCBI 的 OMIM 数据库中 进行非综合征型耳聋的搜索，获得与其相关的热点致病基因，得到相关突变位点信息。
[0072] 2.在NCBI中搜索各相关致病基因的外显子和内含子的序列及位置信息。
[0073] 3.多重PCR引物设计与合成
[0074] 针对以上基因的外显子设计相应PCR引物，根据前述设计原则，共设计了 50对引 物，所有PCR扩增的引物委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，HPLC纯化，具体引物序 列见表2 :
[0075] 表1第一轮PCR引物序列表
[0076] CN 105177160 A 说明书 13/24 页
CN 105177160 A 说明书 16/24 页
[0080] 注：表中六个小写字母的碱基序列为识别序列。
[0081] 4.基因组DNA的提取
[0082] 血液样本来自浙江省某医院，临床诊断为非综合征型耳聋，血液样本200 μ 1，用 QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit (250)试剂盒（货号：69506)进行基因组 DNA 的提取， NanodroplOOO 测浓度为 22ng/ μ 1。
[0083] 第一轮PCR扩增。
[0084] 5. 1以上提取得到的基因组DNA为模板（起始量为30ng)，以表2的50对引物序列 为两端引物，分别进行第一轮PCR扩增，从而分别得到50个扩增产物，分别命名为Pl-I~ Pl-50〇
[0085] 5. 2本轮PCR扩增的体系如下：
CN 105177160 A 说明书 17/24 页
[0088] *Q5 DNA聚合酶购自NEB的Q5扩增试剂盒，货号：E0555L ;
[0089] *5 X Q5 reaction Buffer，货号 B9O27S ;
[0090] *dNTP Mixture 购自 Takara 公司，货号为 4019。
[0091] 5. 3将PCR反应管放于PCR仪上，运行下表所示程序：
[0093] 以上反应结束后，将得到的PCR产物分别用磁珠进行纯化，取5ul PCR产物1 %凝 胶电泳分析PCR产物片段大小，测定PCR产物浓度。
[0094] 6第二轮PCR扩增
[0095] 6. 1步骤5. 3中得到的50个PCR产物进行等量（每个产物30ng)混合后得到混合 液，取50ng作为第二轮PCR扩增的模板，以F2和R2作为第二轮PCR的引物。
[0096] 6. 2PCR反应体系如下：
CN 105177160 A 说明书 18/24 页
[0099] *Q5 DNA聚合酶购自NEB的Q5扩增试剂盒，货号：E0555L ;
[0100] *dNTP Mixture 购自 Takara 公司，货号为 4019。
[0101] 6. 3将PCR反应管放于PCR仪上，运行下表所示程序：
[0103] 以上反应结束后，将得到的PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN)，按照 操作说明纯化扩增产物，此产物即可用于Illumina测序平台进行上机测序。
[0104] 7按标准程序进行Illumina上机。
[0105] 二、结果分析
[0106] 1.对Illumina Miseq测序仪产生的原始数据，采用BWA比对算法软件进行原始读 长序列（reads)与参考基因组进行初步比对。
[0107] 2.重新比对与重新校准处理
[0108] 分别采用三种重要的工具：（1)碱基质量得分重新矫正；（2) indel临近区域局部 重新匹配比对处理；（3)屏蔽重复读长序列。屏蔽重复测序读长的处理目的是考虑处理在 pair-end测序双端存在的由PCR所导致的序列冗余，同时用于处理重复读长在indel区域 内所获得边界存在不同匹配的情形（1)高效率的与已知位点（indeLSNP)进行重新匹配与 比对处理，可对低覆盖度区域进行操作（仅对已知indel进行重新匹配）。（2)采用碱基错 配方式用以判定位点是否需要重新匹配比对，并进行全面的局部重新匹配处理。
[0109] 3.第二阶段（phase 2)异体识别与基因型计算，首先针对矫正重新匹配的序列进 行比对结果的合并处理，将所有全基因组测序的比对结果进行合并用于后续变异体和基因 型的识别。
[0110] 4.多重样本SNP与Indel识别采用基于贝叶斯基因型似然比模型算法的通用基因 型识别算法对SNP和indel进行识别。贝叶斯基因型似然比模型算法的原理是同时估计在 一个包含N个样本的群体或单独个体样本中最可能出现的基因型和等位基因频率，并准确 计算出每个核苷酸位置上的变异体和基因型的后验概率。通用基因型识别算法用来识别统 计学上所判断的非参考序列等位基因的变异体（SNP、Indel)位置和基因型。
[0111] 5.按标准程序进行Illumina Miseq上机，产出约150M数据量。
[0112] 6.数据分析
[0113] 按照高通量测序常规的生物信息分析技术，得到的病人样本突变如下表所示（仅 列举了耳聋相关基因）：
[0115] 注：Freq_dbSNP表示该突变在dbSNP数据库中的频率；Freq_HapMap表示该突变 在dbSNP数据库中的频率；Freq_lk genome表示该突变在dbSNP数据库中的频率；**表示 致病突变。
[0116] 结果分析：在OMIM数据库（http: //omim. org)中查询，发现该病人样本中有 两个基因存在致病突变，如表中**表示，SLC26A4基因上（Intron7)发现1个剪切突 变c. 919-2T>C，为纯合子；已有相关文献报道其致病性，且