[0070] 实施例5.调整PCR反应程序
[0071] 本试剂盒因为需要满足不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性，所以需要测 试不同的扩增程序，保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。首先，循 环数测试：分别测试了 28个循环，29个循环，30个循环，31个循环，最佳循环为29。其次， 退火温度测试：分别测试了56°(：，57°(：，58°(：，59°(：，60°(：，62°(：，最佳温度为59度。最终扩 增程序为：
[0072] 95 〇C 2min ；
[0073] 94°C 30S，59°C lmin，72°C Imin 29 循环；
[0074] 60 °C 30min ；
[0075] 4 cC 延伸。
[0076] 本试剂盒检测扩增产物的方法为采用毛细管遗传分析仪或凝胶电泳进行测定。
[0077] 实施例6.本试剂盒在Y染色体家系排查中的应用
[0078] (1)收集案件中的血斑：样本由某公安局提供。
[0079] (2)样本DNA提取：采用法庭科学DNA实验室检验规范【GA-T383-2002】中硅珠法 提取方法。
[0080] (3)样本检测结果数据比对：现场嫌疑人样本、比对到某家系的某男子，分别使用 Database Y27和Yf iIer Plus进行分型，扩增图谱分别见图3、4、5、6，分型结果比对如表6。
[0081] 表6:
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[0084] 首先使用AG⑶Database Y27进行分型和排查，现场嫌疑人样本比对到某家系， 此家系中男性A分型与嫌疑人只有DYS460这一个基因座分型不一致。对此家系男性成员 加做常染色体分型，进行比对。破案后，证实犯罪嫌疑人确实与此男子为同一个家系。事 后，用Yfiler Plus重新进行分型和排查，犯罪嫌疑人和男性A有三个基因座分型不一致， DYS460、DYS518、DYS387Sla/b。此案例中，如果使用Yfiler Plus进行家系排查，因为嫌疑 人与男性A有三个基因座分型不一致，很可能将此家系排除。由此可以看出，在Y-STR家系 排除的应用中，试剂盒中Y染色体快速突变的基因座数量过多，将嫌疑人所在的家系误排 除的风险较大，Database Y27因为27个基因座全部为低突变率基因座，更加适合男性家系 排查。
[0085] 实施例7.本试剂盒在亲权鉴定中的应用
[0086] (1)收集口腔脱落细胞：样本由某司法鉴定中提供。
[0087] (2)样本DNA提取：采用法庭科学DNA实验室检验规范【GA-T383-2002】中硅珠法 提取方法。
[0088] (3)样本检测结果数据比对：叔叔和侄子扩增图谱分别见图7和8,分型结果比对 如表7所示。
[0089] 表 7 :
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[0092] 结果显示：叔、侄24个Y STR的检测结果完全一致，说明他们属于同一个男性家 族。但是Y染色体检测的特殊性，并不能确定他们之间叔侄关系，需要进一步对常染色体， 甚至更多家庭成员进行检测。所以，本发明提供的试剂盒在亲子鉴定中一般作为常染色体 鉴定结果的补充与佐证。
【主权项】
1. 人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，包含27 个STR基因座的特异性扩增引物对，所述27个STR基因座为：DYS392、DYS389I、DYS447、 DYS389II、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、 DYS385a、DYS385b、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、Y_GATA_H4、 DYS439、DYS635、DYS444、DYS643。2. 根据权利要求I所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：27个基因座的特异 性扩增引物的序列如SEQIDNO:I-SEQIDNO:48所示。3. 根据权利要求2所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述特异性扩 增引物浓度分别为：SEQIDNO: 1~2 0.06yM、SEQIDNO: 3~4 0.05yM、SEQIDNO: 5~6 0? 12yM、SEQIDNO: 7~8 0.06yM、SEQIDNO: 9~10 0.08yM、SEQIDNO: 11~12 0. 16ySEQIDNO: 13-14 0. 05ySEQIDNO: 15-16 0. 05ySEQIDNO: 17-18 0. 12ySEQIDNO: 19-20 0. IlyM^SEQIDNO: 21-22 0. 06 ySEQIDNO: 23-24 0. 09ySEQIDNO:25-26 0. IlyM^SEQIDNO:27-28 0. 05 ySEQIDNO:29-30 0. 08ySEQIDNO: 31-32 0. 07ySEQIDNO: 33-34 0. 15 ySEQIDNO: 35-36 0. 16ySEQIDN0:37~38 0. IlyM^SEQIDN0:39~40 0. 13 ySEQIDN0:41~42 0.llyM、SEQIDN0:43~44 0. 14yM、SEQIDN0:45~46 0. 15yM、SEQIDN0:47~48 0? 16yM〇4. 根据权利要求2所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述特异性扩增引 物分组进行荧光染料标记，每对引物中至少有一条引物的5'端用荧光染料标记。5. 根据权利要求4所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述特异性扩增 引物分组进行荧光染料标记的分组方式为：DYS392、DYS389I、DYS447、DYS389II、DYS438、 DYS527a、DYS527b、DYS522 为第一组；DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a、 DYS385b为第二组；0￥5481、0￥5437、0￥5390、0￥5460、0￥5533、0￥5458，为第三组 ；0￥5393、丫_ GATAJM、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643,为第四组。6. 根据权利要求4所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述标记的荧光染 料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX中任意一种，且每组之间都不相同。7. 根据权利要求4所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：还包括反应混合 液、热启动7?滿和sdH20,所述反应混合液组成为：MgCl2 7. 5mM，Tris-HCl125mM，KCl 125mM,dNTPs7. 5mM,BSA2g/L〇8. 权利要求1~7中任意一项所述的荧光标记复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲子鉴定或 DNA家谱构建中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将试剂盒内试剂与样品DNA装入PCR 扩增管，置于热循环仪上，进行PCR扩增，扩增程序为：95°C2min;94°C30s、59°Clmin、 72°Clmin，共29个循环；60°C终延伸30min;4°C保温得到扩增产物，将扩增产物在遗传分 析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件GeneMapper分析基因测序仪上检测到的数据。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述样品DNA包括利用Chelex法、磁珠 提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因组DNA，或者免提取的滤纸、FTA卡、棉签、 纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，可在单个反应中多重扩增Y染色体上27个低突变率STR基因座。本发明通过设计独特的基因座排布方式及特异性的引物序列，将27个基因座分为4组，每组分别标记不同的荧光标记。本发明的复合扩增系统为市面上检测基因座数量最多的Y-STR试剂盒之一，而且包含的基因座全部为低突变率Y-STR基因座，更加适合男性家系排查。该复合扩增系统引物特异性好、温度耐受范围广、检材适应性强。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105177146
【申请号】
【发明人】郑卫国, 李科杰, 陈拓, 梅兴林, 郭育林
【申请人】无锡中德美联生物技术有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月21日