br>[0029] 4°C 延伸。
[0030] 本试剂盒检测扩增产物的方法为毛细管电泳。
[0031] 本试剂盒具有很强的检材适应性包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提 法中任意一种提取的人基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类 血液或口腔细胞。
[0032] 本试剂盒应用广泛，可用于法医个体识别、亲权鉴定（被拐卖儿童、灾难中遇害者 遗体认定）及DNA家谱构建。
[0033] 所述的荧光标记复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲子鉴定或DNA家谱构建中的应 用。将试剂盒内试剂与样品DNA装入PCR扩增管，置于热循环仪上，进行PCR扩增，扩增程 序为：95°C 2min ;94°C 30s、59°C lmin、72°C lmin，共 29 个循环；60°C终延伸 30min ;4°C保温 得到扩增产物，将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件GeneMapper 分析基因测序仪上检测到的数据。
[0034] 所述样品DNA包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的 人基因组DNA(提取检材的来源包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器 官），或者免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
[0035] 与同类试剂盒相比较，本试剂盒的优点及有益效果如下：
[0036] 1、本试剂盒采用全部低突变率基因座，更加适合Y-STR建库家系排查。
[0037] 2、本试剂盒是包含27个Y染色体STR基因座的高度复合扩增系统，为市面基因座 数量最多的Y-STR检测产品之一。
[0038] 3、本试剂盒具有很强的检材适应性，即一种试剂盒可以扩增多种检材的样本，不 同检材的样本包括：利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因 组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
[0039] 4、本试剂盒通过设计特异性引物，具有较强的扩增特异性（男性样本无非特异性 峰，女性样本无扩增）及温度耐受性（温度耐受范围较广，为了保证不同质量的PCR扩增仪 均能得到较好的扩增结果）。
[0040] 5、本试剂盒应用五色荧光系统，将27个Y染色体STR基因座排布成四色，大大提 高了每一色排布的空间利用率。另外，五色荧光系统应用门槛低，便于以后荧光系统升级， 增加新的焚光，可以排布更多的STR基因座，从而进一步提尚样本个体识别力。
【附图说明】
[0041 ] 图1.基因座排布不意图；
[0042] 图2. Database Y27 27个基因座等位基因分型标准物：Allelic Ladder图；
[0043] 图3.案件中嫌疑人现场检材Y-STR分型图（Database Y27);
[0044] 图4.案件中嫌疑人比对的某家系中男子Y-STR分型图（Database Y27);
[0045] 图5.案件中嫌疑人现场检材Y-STR分型图（Yfiler Plus);
[0046] 图6.案件中嫌疑人比对的某家系中男子Y-STR分型图（Yfiler Plus);
[0047] 图7.缺少双亲的亲权鉴定中叔叔的Y-STR分型图；
[0048] 图8.缺少双亲的亲权鉴定中侄子的Y-STR分型图；
【具体实施方式】
[0049] 实施例1. Y染色体STR基因座的筛选
[0050] 通过对 DYS549、DYS522、DYS389I/II、DYS439、DYS447、DYS392、DYS576、DYS19、 DYS388、DYS391、DYS635、DYS460、DYS456、DYS533、DYS520、DYS438、DYS527a/b、DYS449、 DYS709、DYS622、DYS481、DYS437、DYS390、DYS630、DYS448、H4、DYS458、DYS607、DYS393、 DYS552、DYS570、DYS385a/b、DYS593、DYS444 和 DYS643 共 38 个 Y 染色体 STR 基因座的基 因多态性和突变率的研究，最后筛选出DYS392、DYS389I/II、DYS447、DYS438、DYS527a/ b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a/b、DYS481、DYS437、DYS390、 DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643,共 27 个 Y 染色体STR基因座。每个基因座相应信息见表4 :
[0051] 表 4. Database Y27 基因座信息
[0052] CN 105177146 A 说明书 8/12 页
[0054] 实施例2. 27个Y染色体STR基因座排布
[0055] 根据以上27个基因座，设计了独特的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方 法：DYS392、DYS389I/II、DYS447、DYS438、DYS527a/b、DYS522 为第一组，荧光染料标记物为 6-FAM ;DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a/b 为第二组，荧光染料标记物为 HEX ;DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458 为第三组，荧光染料标记物为 TAMRA ; DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643 为第四组，荧光染料标记物为 R0X，基 因座排布如图1。
[0056] 实施例3. 27个Y染色体STR基因座特异性引物设计及不同引物浓度调试
[0057] 随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越 严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试 及摸索复扩系统中引物之间特异的浓度比例，最终保证了不降低试剂盒特异性及灵敏度的 情况下复合更多的STR基因座。
[0058] (1)特异性引物设计
[0059] 设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域 进行引物设计。
[0060] a.引物Tm值：由于算法不一样，不同软件设计的引物Tm值不尽相同，但需要尽可 能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2°C。
[0061] b.引物间二聚体：尽可能避免两条引物3'末端之间有连续超过3个碱基互补配 对。
[0062] c.引物与模板序列非特异结合：设计过程中尽量避免引物序列与模板序列非特 异区域结合。
[0063] d.引物比对：引物序列需要利用NCBI进行blast比对，除了特异性引物结合区 外，匹配区域越少越好。
[0064] ⑵引物验证
[0065] 首先，进行引物的单扩实验，排除有非特异、扩增效率低的引物；其次，进行单色小 复扩实验，即将每一组引物分别单独混合测试，和单扩一样，需要排除产生非特异及扩增效 率低的引物；最后，进行大复扩实验，即四组引物全部混合测试，在初步确定了各基因座复 合扩增引物后，进行引物的初步组配，利用标准DNA以及其他实际DNA样本为模板，考察每 个基因座引物的浓度及检测效率，考察非特异扩增产物，若存在，即通过调整引物序列的方 式，对引物序列加以改进，最终引物序列及浓度见表2。
[0066] 实施例4.调整PCR反应混合液
[0067] PCR 体系中，Mg2+浓度分别测试(λ 5mM、L OmM、L 5mM 2. 0mM、2. 5mM、3. OmM 6 个梯 度，dNTPs 浓度分别测试 0. lmM、0. 15mM、0. 2mM、0. 25mM、0. 30mM、0. 35mM 6 个梯度，热启动 Taq 酶含量分别测试 1.0 U、I. 5U、2. 0U、2. 5U、3. OU 共 5 梯度，Tris-HCl 浓度定 10mM，KCl 浓 度定为40mM。通过设计正交实验，最终将Mg2+浓度定为2. OmM，dNTPs浓度定为0. 25mM，热 启动Taq酶含量2. 0U，Tris-HCl浓度定10mM，KC140mM，利用以上材料制备成反应混合液 ReactionMix，加入到PCR体系中。最终PCR体系各组成见表5。
[0068] 表 5 :