全后可加入适量 PBS，然后直接回收到离心管中，获取足够多的细胞并进行细胞计数以备实验使用。
[0043] 2.细胞石蜡包埋：
[0044] 共计4份样本细胞，分别如下：
[0045] 将B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375与无 B-raf基因突 变的细胞株人胚肾细胞HEK 293V按照1 :4混合，得到20 %突变比例的细胞混合液；
[0046] 将B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375与无 B-raf基因突 变的细胞株人胚肾细胞HEK 293V按照1 :1混合，得到50%突变比例的细胞混合液；
[0047] B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375的细胞液；
[0048] 无 B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK 293V的细胞液。
[0049] 下边以无 B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK 293V为例，按照石蜡包埋的步 骤，从细胞的收集，固定，细胞脱水，细胞透明，细胞的石蜡包埋步骤，完成细胞的石蜡包埋 步骤，具体介绍如下：
[0050] (1)细胞收集：将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中，1500r/min离心5 分钟，弃上清。
[0051] (2)细胞固定：向离心管中加入适量的10%的中性福尔马林，摇匀后斜放在4度冰 箱中固定60分钟，然后1500r/min离心5分钟，弃上清；加入适量PBS清洗一次，1500r/min 离心5分钟，弃上清，保留少许PBS以用作混匀细胞。
[0052] (3)细胞脱水：按照乙醇浓度从低到高的梯度进行，每步脱水完成时1500r/min离 心5分钟，弃上清：50%乙醇30分钟；
[0053] 70 %乙醇30分钟；85 %乙醇30分钟；95 %乙醇30分钟；100 %乙醇20分钟；100 % 乙醇20分钟。
[0054] (4)细胞透明：用二甲苯逐步替代掉无水乙醇，在通风橱中进行，具体操作如下： 先以1/2的无水乙醇加1/2的二甲苯20分钟，吸去上清；再1/3无水乙醇加2/3二甲苯20 分钟，吸去上清；然后换成二甲苯20分钟，吸去二甲苯后即可进行细胞的石蜡包埋步骤。
[0055] (5)石蜡包埋：用石蜡逐步替代二甲苯，在62°C环境下于通风橱中进行操作，具体 操作如下：1/2二甲苯加1/2的石蜡30分钟，吸去二甲苯及石蜡；完全石蜡1小时，对细胞 进行初步包埋，待石蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪，得到含有细胞的石蜡包埋块；然后 进行二次包埋，用石蜡包埋1小时，降温，待石蜡凝固即可。
[0056] 按照上述步骤制备其余3种样本细胞。
[0057] 利用石蜡提取试剂盒（天根石蜡包埋组织提取试剂盒DP331，天根生化科技（北 京）有限公司）对制备的细胞石蜡切片进行核算提取，获取各混合的DNA，做好标记，以备使 用。
[0058] 3.检测反应：采用B-raf检测试剂盒，所述试剂盒包括Real-Time PCR Master Mixture 和 B-raf 基因突变引物探针混合液，取 Real-Time PCR Master Mixturel2. 5 μ 1， B-raf基因突变引物探针混合液4. 5 μ 1配制成反应体系，再加入灭菌双蒸水6 μ 1，然后加 入2. 0 μ 1待检模板。
[0059] 每批次反应均设置阴性质控（H2O)。
[0060] 反应条件：94°C，4分钟；94°C，15秒；60°C，35秒，40个循环。
[0061] 采用step one plus荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信 号收集设在60 °C。
[0062] 4.结果判断：依次确定各反应管突变Ct值（CtM)和外控Ct值（CtW)，计算各管的 ACt值（CtM-CtW)，根据突变比例的不同，可将检测结果分为阴性（或低于试剂盒检测下 限：0% -1%突变）、阳性（5% -100%突变）。
[0064] 利用上述方法对制备的20%突变比例及50%突变比例的细胞混合物的石蜡切 片，纯突变以及无突变石蜡切片，共计4份样本进行检测，结果如图1所示，测序结果如图 2_1、2_2、2_3、2_4 所不。
[0065] 其中，无 B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK 293V的样本检测结果Λ Ct值 (CtM-CtW)大于8,其余组的均小于8,符合预期实验结果要求。
[0066] 在样品制备3个月后，进行同样实验，即对上述4份样本进行检测，结果如图3所 不。
[0067] 其中，无 B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK 293V的样本检测结果Λ Ct值 (CtM-CtW)大于8,其余组的均小于8,符合预期实验结果要求，同时，本次检测结果与三个 月前结果比较，无明显ct值的变化，证实稳定性较好。
[0068] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种细胞源性质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 、细胞的准备 1) 细胞的复苏：从液氮罐中取出对应细胞冻存管，放入备好的42°C温水中快速摇动， 直至管中的液体恢复常温；于超净台中将冻存管用质量百分含量75%酒精擦拭消毒后，打 开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加5mL培养液，在1500r/min速度下离心5 分钟，弃去上层液，加入培养液后接种于培养皿中，置37°C温箱静置培养； 2) 细胞传代培养：于超净台中取复苏的培养细胞，吸去培养皿中的培养液，沿皿壁加 入2mL的IXPBS清洗细胞，吸去PBS，再用PBS清洗一次； 向培养皿中加入0. 5mL的质量百分含量为0. 25 %胰酶，摇晃培养皿使胰酶与皿底细胞 充分接触消化，Imin后吸去胰酶，于显微镜下观察细胞状态，至细胞基本恢复圆滑状态； 向培养皿中加入3mL培养液，用移液器将皿底细胞来回吹打混匀，显微镜下观察细胞 浓度，视细胞浓度向另一培养皿中加入600~1500 y 1的细胞悬浮液，并加入3mL培养液， 用移液器轻轻吹打混匀，显微镜下观察细胞密度； 置37°C温箱静置培养，观察生长情况； 3) 细胞的收集：贴壁生长于培养皿中的细胞，用胰酶消化完全后直接回收到离心管 中，收集完毕的细胞放在〇°C冰箱保存； (2) 、细胞的石蜡包埋 1) 细胞收集：将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中，1500r/min离心5分钟， 弃上清； 2) 细胞固定：向离心管中加入质量百分含量10%的中性福尔马林，摇匀后斜放在4度 冰箱中固定60分钟，然后1500r/min离心5分钟，弃上清；加入适量PBS清洗一次，1500r/ min离心5分钟，弃上清，保留少许PBS以用作混匀细胞； 3) 细胞脱水：按照乙醇浓度从低到高的梯度进行，每步脱水完成时1500r/min离心5 分钟，弃上清：50%乙醇30分钟； 70 %乙醇30分钟；85 %乙醇30分钟；95 %乙醇30分钟；100 %乙醇20分钟；100 %乙 醇20分钟； 4) 石蜡包埋：在62°C环境下于通风橱中进行操作，具体操作如下：1/2体积的二甲苯加 1/2体积的石蜡30分钟，吸去二甲苯及石蜡；完全石蜡1小时，对细胞进行初步包埋，待石 蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪，得到含有细胞的石蜡包埋块；然后进行二次包埋，用石 蜡包埋1小时，降温，待石蜡凝固即可。2. 如权利要求1所述的细胞源性质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中2) 细胞传代培养和3)细胞的收集之间还包括细胞的冻存，具体步骤如下： 配制冻存液：按如下体积比例DMEM:FBS=DMSO= 7:2:1来配制冻存液，将细胞培养液、PBS、胰蛋白酶和冻存液温浴到37°C; 冻存时的细胞要生长状态好、生长旺的细胞，用细胞传代方法消化细胞，用适量细胞培 养液终止消化，重悬细胞；室温200g离心10分钟收集细胞，用冻存液重悬细胞，并调节浓度 至约1\106个细胞，4 ￡€30!^11，转到-201€30111111，再在-80°(：过夜；将细胞转入液氮中。3. 如权利要求1所述的细胞源性质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中3) 细胞脱水和4)石蜡包埋之间还包括：细胞透明，具体过程如下：用二甲苯逐步替代掉无水 乙醇，在通风橱中进行，具体操作如下：先以1/2体积的无水乙醇加1/2体积的二甲苯20分 钟，吸去上清；再1/3体积无水乙醇加2/3体积二甲苯20分钟，吸去上清；然后换成二甲苯 20分钟，吸去二甲苯后即可进行细胞的石蜡包埋步骤。4.如权利要求1所述的细胞源质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中的3) 细胞的收集，具体为：贴壁生长于培养皿中的细胞，在用胰酶消化完全后可加入PBS，然后 直接回收到离心管中。
【专利摘要】本发明涉及细胞系质控品制备方法，具体讲，涉及一种细胞源性质控品的制备方法。所述制备方法包括如下步骤：细胞的准备和细胞的石蜡包埋；其中，细胞的准备包括细胞的复苏、细胞传代培养和细胞的收集；细胞的石蜡包埋包括细胞收集、细胞固定、细胞脱水、石蜡包埋。所述制备方法是直接用含有相关基因片段的细胞来制备质控品，其质控品本身就是来源于含有相同突变的肿瘤细胞，和样本的来源相同，其与要检测的样本本身同源性更好，与样本更接近，使得检测结果更具有说服力，适合于大范围推广。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105177124
【申请号】
【发明人】刘昌军, 刘沛, 朱柳, 丁朋举, 李江浩
【申请人】北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月20日