一种细胞源性质控品的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞系质控品制备方法，具体讲，涉及一种细胞源性质控品的制备方 法及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着生物技术及分子生物学的发展，各种疾病诊断试剂盒也越来越多，随着技术 的成熟，其中的质控品部分是检测试剂盒非常重要的组成部分，特别是定量检测试剂盒。目 前市面上的试剂盒质控品主要使用的是质粒，质粒适用范围广，几乎所有的基因检测类试 剂盒质控品均可选择使用质粒。但是质粒制备不仅过程繁琐，而且需要在_20°C下低温储 存，随着冻融次数增加，降解情况严重，稳定性不好，给试剂盒质控带来诸多不便；同时质粒 作为一种质控品，与待检样本同源性存在较大差异，特别是一些需要定量检测的产品，用质 粒进行定量不具有说服力；并且对于不同批次间的产品，也会由于质粒的生产时间不同而 导致检测结果的不同，给疾病检测带来诸多不便。
[0003] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种细胞源性质控品的制备方法；
[0005] 本发明提供一种细胞源性质控品在肿瘤基因突变检测中的应用。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：一种细胞源质控品的 制备方法，包括如下步骤：
[0007] (1)、细胞的准备
[0008] 1)细胞的复苏：提前备好42°C的温水，按要求从液氮罐中取出对应细胞冻存管， 立即放入备好的温水中快速摇动，直至管中的液体恢复常温。于超净台中将冻存管用质量 百分含量75 %酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加 5mL培 养液。在1500r/min速度下离心5分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养皿中， 置37°C温箱静置培养。观察生长情况，若细胞密度较高，几乎全部铺满皿底时及时进行传 代。培养过程中严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败；
[0009] 2)细胞传代培养：本步骤须在超净台中操作。取生长适宜的培养细胞，吸去培养 皿中的培养液，沿皿壁加入2mL(视培养皿大小加入适量即可）的IxPBS轻轻清洗细胞，吸 去PBS ;再用PBS再清洗一次；
[0010] 向培养皿中加入0. 5mL的质量百分含量为0. 25 %胰酶，轻轻摇晃培养皿使胰酶与 皿底细胞充分接触消化，Imin后吸去胰酶，于显微镜下观察细胞状态，若细胞基本恢复圆滑 状态，即可进行下一步操作，若还有贴壁情况，则继续消化直至细胞变得圆滑。注意胰酶消 化时间过短过长都不好，过短消化不完全，过长可能对细胞膜造成一定损伤，都不利于细胞 的继续传代；
[0011] 向培养皿中加入3mL培养液（视培养大小加入适量即可），用移液器将皿底细胞轻 轻来回吹打混匀，显微镜下观察细胞浓度，视细胞浓度向另一培养皿中加入600~1500 μ I 的细胞悬浮液，并加入3mL培养液，用移液器轻轻吹打混匀，显微镜下观察细胞密度。注意 步骤中的培养液及细胞悬浮液均可根据实际情况进行变动；
[0012] 置37 °C温箱静置培养。观察生长情况，若细胞密度较高，几乎全部铺满皿底时及时 进行传代；
[0013] 3)细胞的收集：贴壁生长于培养皿中的细胞，当需要收集时，在用胰酶消化完全 后可加入适量PBS，然后直接回收到离心管中。或者不加 PBS直接收集胰酶消化的细胞。收 集完毕的细胞可暂时放在〇°C冰箱保存，长时间不用的细胞最好保存在-80°C冰箱中备用；
[0014] (2)、细胞的石蜡包埋
[0015] 1)细胞收集：将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中，1500r/min离心5分 钟，弃上清；
[0016] 2)细胞固定：向离心管中加入适量的质量百分含量10%的中性福尔马林，摇匀后 斜放在4度冰箱中固定60分钟，然后1500r/min离心5分钟，弃上清；加入适量PBS清洗一 次，1500r/min离心5分钟，弃上清，保留少许PBS以用作混匀细胞；
[0017] 3)细胞脱水：按照乙醇浓度从低到高的梯度进行，每步脱水完成时1500r/min离 心5分钟，弃上清：50%乙醇30分钟；
[0018] 70 %乙醇30分钟；85 %乙醇30分钟；95 %乙醇30分钟；100 %乙醇20分钟；100 % 乙醇20分钟；
[0019] 4)石蜡包埋：在62°C环境下于通风橱中进行操作，具体操作如下：1/2体积二甲苯 加1/2体积的石蜡30分钟，吸去二甲苯及石蜡；完全石蜡1小时，对细胞进行初步包埋，待 石蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪，得到含有细胞的石蜡包埋块；然后进行二次包埋，用 石蜡包埋1小时，降温，待石蜡凝固即可。
[0020] 作为本发明的优选方案，所述步骤（1)中2)细胞传代培养和3)细胞的收集之间 还包括细胞的冻存，具体步骤如下：
[0021] 配制冻存液：按如下体积比例DMEM: FBS: DMSO = 7:2:1来配制冻存液。（一定要 现配现用）将细胞培养液、PBS、胰蛋白酶和冻存液温浴到37°C。
[0022] 冻存时的细胞要生长状态好、生长旺的细胞（最好在第3或者4带时冻存），用细 胞传代方法消化细胞，用适量细胞培养液终止消化，重悬细胞。室温200g离心10分钟收集 细胞，用冻存液重悬细胞，并调节浓度至约lx IO6个细胞，4°C 30min，转到-20°C 30min，再 在-80 °C过夜；将细胞转入液氮中。
[0023] 作为本发明的优选方案，所述步骤（2)中3)细胞脱水和4)石蜡包埋之间还包括： 细胞透明，具体过程如下：用二甲苯逐步替代掉无水乙醇，在通风橱中进行，具体操作如下： 先以1/2体积的无水乙醇加1/2体积的二甲苯20分钟，吸去上清；再1/3体积无水乙醇加 2/3体积二甲苯20分钟，吸去上清；然后换做二甲苯20分钟，吸去二甲苯后即可进行细胞 的石蜡包埋步骤。
[0024] 采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
[0025] (1)本制备方法是直接用含有相关基因片段的细胞来制备质控品，其质控品本身 就是来源于含有相同突变的肿瘤细胞，和样本的来源相同，其与要检测的样本本身同源性 更好，与样本更接近，使得检测结果更具有说服力，适合于大范围推广；
[0026] (2)将细胞制备成石蜡切片，其储存方便，与质粒易降解相比稳定性更好，同时可 与样本同时提取，与样本有着同样的操作过程，相较于质粒，减小了实验过程中的误差以及 对突变检测结果的影响；
[0027] (3)此制备方法制备的细胞源性质控品适合于所有肿瘤突变检测，只要有相关的 肿瘤细胞，即可进行相关检测对应的质控品，有利于提高肿瘤突变检测的准确性，更完美的 配合肿瘤疾病的治疗。
【附图说明】
[0028] 图1为采用荧光定量PCR仪检B-raf基因突变细胞源性质控品得到的曲线；
[0029] 图2-1为B-raf基因 20%突变比例测序结果；
[0030] 图2-2为B-raf基因 50%突变比例测序结果；
[0031] 图2-3为B-raf基因纯突变比例测序结果；
[0032] 图2-4为B-raf基因无突变比例测序结果；
[0033] 图3为B-raf基因突变细胞源性质控品石蜡切片放置3个月后的检测结果。
【具体实施方式】
[0034] 以下结合具体实施例和附图对本发明做进一步解释说明。
[0035] B-raf基因突变细胞源性质控品的制备
[0036] 1.细胞的准备：针对B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375 以及无 B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK 293V。
[0037] (1)细胞的复苏：提前备好42°C的温水，按要求从液氮罐中取出肿瘤细胞株人恶 性黑色素瘤细胞A375以及无 B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V，立即放入备好 的温水中快速摇动，直至管中的液体恢复常温。于超净台中将冻存管用75%酒精擦拭消毒 后，打开盖子，用吸管将细胞悬液分别注入离心管中，再滴加5mL培养液。在1500r/min速 度下离心5分钟，弃去上层液，将肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375加入到BMEM高糖培 养液、将无 B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK 293V加入到RPMI1640培养液中，接种 于培养皿中，置37°C温箱静置培养。观察生长情况，若细胞密度较高，几乎全部铺满皿底时 及时进行传代。
[0038] (2)细胞传代培养：本步骤须在超净台中操作。分别取生长适宜的肿瘤细胞株人 恶性黑色素瘤细胞A375以及无 B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK 293V，吸去培养皿 中的培养液，沿皿壁加入2mL(视培养皿大小加入适量即可）的IxPBS轻轻清洗细胞，吸去 PBS ;再用PBS再清洗一次；
[0039] 向培养皿中分别加入0. 5mL的质量百分含量为0. 25%的胰酶，轻轻摇晃培养皿使 胰酶与皿底细胞充分接触消化，Imin后吸去胰酶，于显微镜下观察细胞状态，若细胞基本恢 复圆滑状态，即可进行下一步操作，若还有贴壁情况，则继续消化直至细胞变得圆滑。
[0040] 分别向培养皿中加入3mL对应的培养液（视培养大小加入适量即可），用移液器 将皿底细胞轻轻来回吹打混匀，显微镜下观察细胞浓度，视细胞浓度向另一培养皿中加入 600~1500 μ 1的细胞悬浮液，并加入3mL对应的培养液，用移液器轻轻吹打混匀，显微镜下 观察细胞密度。
[0041 ] 置37 °C温箱静置培养。观察生长情况，若细胞密度较高，几乎全部铺满皿底时及时 进行传代。
[0042] (3)细胞的收集：贴壁生长于培养皿中的细胞，在用胰酶消化完