V/V/V)中展开，经碘蒸气略微显色后刮下磷脂、甘油三酯和乙酯条带，分别甲酯 化后采用气相色谱法分析，利用面积归一化法计算各脂肪酸的相对含量。
[0071] 气相色谱条件为：所用气相色谱仪为配有进样口为分流/不分流进样口的 Agilent 6890气相色谱仪，进样口温度为250°C，分流比为20:1 ;分析柱选用HP-INNOWax 石英毛细管柱（30mX0. 32mmX0. 25 μπι)，采用梯度升温，初始温度为170°C，以3°C /min升 温至210°C并保持30min，其载气为高纯氮气（99. 999% )，载气流速为lmL/min ;检测器为 火焰离子化检测器（FID)，检测器温度280°C，氢气、空气和尾吹气（高纯氮气）的流速分别 为 40mL/min、450mL/min 和 40mL/min〇
[0072] 磷脂组成的测定方法如下：
[0073] 样品经冷丙酮洗涤后收集沉淀部分，挥干溶剂后溶于氯仿-甲醇混合液（4:1，V/ V)中，进行高效液相色谱分析，自动积分获得各磷脂组成的峰面积，根据标准曲线计算各磷 脂成分的含量。
[0074] 高效液相色谱分析为：采用1100型液相色谱仪，检测器为美国Alltech公司的 2000ELSD型蒸发光散射检测器，分析柱为Rx-SIL型正相硅胶色谱分析柱（250mmX4. 6mm i. d.，5 μπι);流动相采用梯度洗脱，流动相A为氯仿-甲醇-氨水（80:19. 5:0. 5, V/V/V)， 流动相B为氯仿-甲醇-水-氨水（60:34:0. 5:5. 5，V/V/V/V)，流速为l.Oml/min，梯度洗 脱程序如下表所示：
[0076] 通常认为，在液液双相反应体系以磷脂酶D为催化剂制备磷脂酰丝氨酸的研究 中，具有双取代氧基团的溶剂对磷脂酶D具有激活作用，因此用乙醚或乙酸乙酯的反应过 程能够获得较高的反应效率，但这两种溶剂沸点低、易燃易爆，且有一定的毒性，在实际工 业化生产中存在安全性问题。
[0077] 而碳原子数大于10的中长链脂肪酸乙酯具备双取代氧基团，可加入以磷脂酶D为 催化剂的液液双相反应体系中用于工业化生产。中长链脂肪酸乙酯的沸点高，不易挥发，且 具备一定的食用安全性，如可作为食品添加剂的辛酸乙酯的沸点为206°C，含有EPA和DHA 的鱼油乙酯可作为保健食品原料用于软胶囊的生产。反应结束后，可通过分子蒸馏技术全 部或部分除去中长链脂肪酸乙酯。磷脂不耐高温，但研究发现，在高度真空的条件下，中性 油脂（如脂肪酸乙酯、甘油三酯等）的存在对高温下的磷脂具有保护作用。
[0078] 本发明所述的先以磷脂酶D催化海洋动物磷脂和L-丝氨酸的碱基交换反应，再经 离心和分子蒸馏，分离纯化后制得磷脂酰丝氨酸；利用中长链脂肪酸乙酯与缓冲液形成的 液液双相反应体系，用高沸点且食用安全的中长链脂肪酸乙酯替代乙醚和乙酸乙酯等沸点 低、易燃易爆且有毒害的有机溶剂，保证了反应效率的同时提高了生产安全性，避免造成环 境污染，适于工业化生产。
[0079] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任 何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等 效实施例。但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作 的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
[0080] 本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。
【主权项】
1. 一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于：包括下列步骤： (1) 从海洋动物中提取得磷脂原料； (2) 将步骤（1)中得到的磷脂原料溶解于中长链脂肪酸乙酯，得到溶液A; ⑶将磷脂酶D和L-丝氨酸溶解于PH值为4. 5~6.O的醋酸缓冲液中，得到溶液B; (4) 将步骤⑵中得到的溶液A加入步骤（3)中得到的溶液B中，得到混合溶液C，把 得到的混合溶液C加热、搅拌反应，得到反应后的溶液D; (5) 将步骤（4)中得到的反应后的溶液D采用离心方法去掉水相得到油相； (6) 将步骤（5)中得到的油相采用分子蒸馏方法脱除中长链脂肪酸乙酯，收集分子蒸 馏重相，即制得磷脂酰丝氨酸。2. 根据权利要求1所述的一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于：步骤（1)所述 的磷脂原料中总磷脂含量为40%~80% ;步骤（2)所述的中长链脂肪酸乙酯为辛酸乙酯、 鱼油乙酯、油酸乙酯或DHA乙酯中的一种或两种以上的混合物；步骤（3)所述磷脂酶D的活 力为 80 ~100U/mg。3. 根据权利要求1所述的一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于：所述的磷脂原 料与中长链脂肪酸乙酯的重量比为1:0. 5~10,所述磷脂酶D的加入量为磷脂原料重量的 1 %~10 %，所述L-丝氨酸的加入量为磷脂原料重量的10 %~300 %，所述缓冲液的加入量 为磷脂原料重量的200 %~2000%。4. 根据权利要求1所述的一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（4) 中加热、搅拌反应的反应温度为20~60°C，反应时间为4~24h;所述步骤（6)中分子蒸馏 的蒸馏温度为60~120°C，蒸馏压力为0? 1~20Pa。5. -种如权利要求1至4任一所述方法制备而成的磷脂酰丝氨酸。6. -种制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于：包括下列步骤： (1) 从海洋动物中提取得磷脂原料； (2) 将步骤（1)中得到的磷脂原料溶解于中长链脂肪酸乙酯，得到溶液A; ⑶将磷脂酶D、L-丝氨酸和氯化钙溶解于PH值为4. 5~6. 0的醋酸缓冲液中，得到 溶液B'; (4) 将步骤（2)中得到的溶液A加入步骤（3)中得到的溶液B'中，得到混合溶液C'， 把得到的混合溶液C'加热、搅拌反应，得到反应后的溶液D'; (5) 将步骤（4)中得到的反应后的溶液D'采用离心方法去掉水相得到油相； (6) 将步骤（5)中得到的油相采用分子蒸馏方法脱除中长链脂肪酸乙酯，收集分子蒸 馏重相，即制得磷脂酰丝氨酸。7. 根据权利要求6所述的一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于：步骤（1)所述 的磷脂原料中总磷脂含量为40%~80% ;步骤（2)所述的中长链脂肪酸乙酯为辛酸乙酯、 鱼油乙酯、油酸乙酯或DHA乙酯中的一种或两种以上的混合物；步骤（3)所述磷脂酶D的活 力为 80 ~100U/mg。8. 根据权利要求6所述的一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于：所述的磷脂原 料与中长链脂肪酸乙酯的重量比为1:0. 5~10,所述磷脂酶D的加入量为磷脂原料重量的 1 %~10 %，所述L-丝氨酸的加入量为磷脂原料重量的10 %~300 %，所述缓冲液的加入量 为磷脂原料重量的200 %~2000%。9. 根据权利要求6所述的一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（4) 中加热、搅拌反应的反应温度为20~60°C，反应时间为4~24h;所述步骤（6)中分子蒸馏 的蒸馏温度为60~120°C，蒸馏压力为0? 1~20Pa。10. -种如权利要求6至9任一所述方法制备而成的磷脂酰丝氨酸。
【专利摘要】本发明涉及一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，先以磷脂酶D催化海洋动物磷脂和L-丝氨酸的碱基交换反应，再经离心和分子蒸馏，分离纯化后制得磷脂酰丝氨酸；利用中长链脂肪酸乙酯与缓冲液形成的液液双相反应体系，用高沸点且食用安全的中长链脂肪酸乙酯替代乙醚和乙酸乙酯等沸点低、易燃易爆且有毒害的有机溶剂，保证了反应效率的同时提高了生产安全性，避免造成环境污染，适于工业化生产。
【IPC分类】C12P13/04, C07F9/10
【公开号】CN105177073
【申请号】
【发明人】蔡胜利, 蔡爱英, 孙兆敏, 黄莎莎, 李文平
【申请人】威海博宇食品有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月8日