一种发酵制备富马酸的工艺的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种发酵制备富马酸的工艺。
【背景技术】
[0002]富马酸(Fumaric acid)作为一种重要的有机基本化工原料和大宗化工产品，广泛应用于涂料、树脂、医药、增塑剂、食品添加剂等领域，具有重要的市场价值。同时，以富马酸为原料可以进一步合成多种高价值衍生物，如富马酸二甲酯(DMF)、富马酸亚铁等。另外，富马酸作为一种重要的四碳平台化合物，还可以通过酶催化转化、酯化、加氢等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、1，4-丁二醇、γ-丁内酯和四氢呋喃等四碳化合物。
[0003]目前工业上生产富马酸主要采用化学法，发酵法生产富马酸并未实现工业化，其主要原因是原料费占富马酸生产的很大一部分，降低原材料成本成为生物法制备富马酸的唯一出路，目前生产富马酸的菌主要是米根霉，为了降低原料成本，考虑利用淀粉质原料生产富马酸，但是需要将淀粉质原料通过液化和糖化转化成葡萄糖后再利用，此工艺复杂，而且液化和糖化同样增加了成本，目前，已有文献报道，直接利用米根霉液化液进行同步糖化发酵富马酸，虽然取得了好的效果，但是发酵过程中后期糖耗低，终点残糖含量高，从而导致发酵能耗高、成本高，设备利用率低等。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种发酵制备富马酸的工艺，利用低浓度的淀粉液化液分批发酵，在中后期再向发酵系统中补加一定的淀粉液化液和糖化酶，既避免了高初糖浓度对富马酸发酵的抑制，又可解决后期因菌自身糖化酶活力降低导致糖耗低的问题，同时提高了菌种的利用率，糖酸转化率和设备利用率，降低了生产成本。
[0005]为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是这样的:一种发酵制备富马酸的工艺，包括以下步骤:
1)将淀粉液化液加入种子罐中，同时添加尿素和无机盐，调整pH至2.5-3.5，灭菌后接入米根霉孢子悬浮液，进行种子液培养；
2)将淀粉液化液加入发酵罐中，灭菌后接入经步骤I)培养好的种子液，并向其中加入分消的碳酸钙；
3)待发酵32-38h，将淀粉糖化液和糖化酶作为流加液以20-25mL/h的流加速度向发酵罐内流加，流加液的总加入体积为初始发酵体积的10%-15%，其中，流加液中淀粉糖化液的总糖浓度为60-80g/L，糖化酶的酶活力为4.5 X 15 6.7 X 15 U/mL。
[0006]初糖总糖过高则抑制菌体生长，初糖总糖过低则菌体生长旺盛，抑制磷酸果糖激酶的活性，降低菌体发酵前期产酸速率，因而所述的发酵罐中淀粉液化液的初始总糖浓度优选为40-60g/L。
[0007]优选地，所述的淀粉液化液的具体制备过程:淀粉质原料与水以8-12% (w/v)的比例混合成糊状后，加热到70-80°C，加入耐高温淀粉酶，加酶量为800?1000 U/g干淀粉质原料，保温10 -20min后继续加热到90_95°C，碘检不变色后继续加热到100°C煮沸5?10min，然后趁热经过3-4层纱布过滤，滤液冷却后加水调整糖度。
[0008]优选地，所述的淀粉糖化液的具体制备过程为:将淀粉液化液加热至50— 60°C，加入糖化酶，保温4-5h，无水酒精检验无糊精存在后，继续加热至70-80°C，保温10-30min，冷却后加水调整糖度。
[0009]富马酸的发酵需要的低氮的条件下进行，为了控制淀粉质原料中的氮含量，所述的淀粉质原料优选自可溶性淀粉、玉米粉、脱胚玉米粉、木薯粉之中的一种或2种的组合。
[0010]优选地，种子罐中淀粉液化液的总糖浓度为25_25g/L。
[0011]优选地，尿素的添加量为2-2.5g/L。
[0012]优选地，所述的无机盐为KH2P04，MgSO4.7H20，ZnSO4和FeSO4.7H20，浓度分别为 0.5-0.6 g/L,0.4-0.55 g/L，0.08-0.15 g/L，0.08-0.09 g/L。
[0013]优选地，种子液接种于发酵罐的接种量为10-15%。
[0014]通过研究发现，生产富马酸的米根霉，其自身具有糖化酶，可直接利用淀粉质原料的液化液来生产富马酸，但是，由于米根霉自身的具备的糖化酶活力不高，在发酵中后期受到发酵产物的抑制，活力进一步下降，因而其利用淀粉质原料液化液来生产富马酸时，容易造成后期糖耗低，终点残糖含量高。
[0015]有益效果:
1、本发明分批发酵中采用低浓度的淀粉液化液作为碳源，在发酵过程中后期(32-38h)，此时耗糖速率下降，糖化酶的活力降低，通过流加技术，补加一定的淀粉糖化液和糖化酶，除能快速补充能够利用的碳源外，匀速流加的商品糖化酶可以不断将未反应的淀粉液化液糖化为可利用的葡糖糖，此工艺既避免了高初糖浓度对富马酸发酵的抑制，提高了富马酸的产量，又解决了发酵终点残糖浓度过高的问题，从而保证富马酸发酵持续高效进行，提高菌种的利用率，糖酸转化率与设备利用率，从而降低发酵成本。
[0016]2、本发明流加液中淀粉糖化液的总糖选择为40_60g/L，糖化酶的酶活选择为4.5 X 15 6.7 X 15 U/mL，流加速度选择为20_25mL/h，这样既为发酵及时提供了碳源，同时因淀粉糖化液中含有一些生长因子如氨基酸、维生素和生物素等，也使其得到了补充，如果太高，反而会导致后期菌体疯长，不利于产酸和转化率的提高，而且还增加了成本；如果太低，起不到作用。
【具体实施方式】
[0017]为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，这些实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
[0018]实施例1
一种发酵制备富马酸的工艺，其特征在于，包括以下步骤，
O将总糖含量为25g/L的脱胚玉米粉液化液加入种子罐中，同时添加2.5g/L尿素，
0.6 g/L KH2PO4，0.55 g/L MgSO4.7Η20，0.15 g/L ZnSO4 和 0.09g/L FeSO4.7H20，调整 pH至2.5，灭菌后接入米根霉孢子悬浮液，进行种子液培养；
2)将3L总糖含量为40g/L脱胚玉米粉液化液加入5L发酵罐中，灭菌后按10%的接种量接入经步骤I)培养好的种子液，并向其中加入分消的碳酸钙40g/L ; 3)于35°C，1 vvm的通气比率、400 rpm的搅拌转速下进行发酵，待发酵32h，将玉米粉糖化液和糖化酶作为流加液，以25mL/h的流加速度向发酵罐内流加，流加液的总加入体积为450mL，其中，流加液中玉米糖化液的总糖浓度为40g/L，糖化酶的酶活为4.5X 15 U/mL。
[0019]其中，所述的脱胚玉米粉液化液的具体制备过程:脱胚玉米粉与水以8% (w/v)的比例混合成糊状后，加热到70-80°C，加入耐高温淀粉酶，加酶量为800?1000 U/g干淀粉质原料，保温10 -20min后继续加热到90_95°C，碘检不变色后继续加热到100°C煮沸5?10 min，然后趁热经过3-4层纱布过滤，滤液冷却后加水调整总糖浓度为40g/L和25g/L。
[0020]脱胚玉米粉糖化液的具体制备过程为:将脱胚玉米粉液化液加热至50— 60°C，加入糖化酶，保温4-5h，无水酒精检验无糊精存在后，继续加热至70-80°C，保温10-30min，冷却后加水调整总糖浓度为40g/L。
[0021]在此条件下，发酵55 h，产酸为39 g/L，残糖为2.5g/L。
[0022]实施例2
一种发酵制备富马酸的工艺，包括以下步骤，
1)将总糖含量为20g/L的木薯粉液化液加入种子罐中，同时添加2g/L尿素，0.5 g/LKH2PO4，0.4 g/L MgSO4.7Η20，0.08 g/L ZnSO4