0. 38M，121°C、45min灭 菌； DNS试剂：制备方法为，称取3, 5-二硝基水杨酸（DNS) lg，溶解于20mL浓度为2mol/L 的氢氧化钠溶液中，然后加入蒸馏水50mL，称取并加入30g四水酒石酸钾钠，溶解后蒸馏水 定容至100mL，密封室温保存，避免CO2进入。
[0015] 实施例1 本发明所提供的改造枯草芽孢杆菌菌株的方法，首先是人工构建不含(敲除）产孢致死 因子基因（?々/)的基因序列，然后将所构建的不含(敲除）产孢致死因子基因（?々/)的基因 序列对枯草芽孢杆菌进行同源重组替换，获得新的敲除(不含）产孢致死因子基因（的 枯草芽孢杆菌菌株，具体包括如下步骤。
[0016] (1)人工构建不含(敲除）产孢致死因子基因（if)的基因序列 所述不含(敲除)产孢致死因子基因（i/)的基因序列，由3部分DNA片段组成，分别是 上游部分序列(片段A)、四环素抗性基因表达序列(片段B)、基因下游部分序列(片 段C);具体序列如序列表SEQ ID NO. 1、表SEQ ID NO. 2、表SEQ ID NO. 3所示。
[0017] 具体构建步骤如下所述： A. 提取总DNA，按照说明书，利用DNA提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌WB800基因组的总 DNA备用； B. 片段A (上游部分序列)的PCR扩增，以步骤A所提取的枯草芽孢杆菌WB800基 因组的总DNA为模板，根据枯草芽孢杆菌基因组序列（GenBank序列号CP010052. 1)设计如 下引物： PLSr -TGCGCTGACGTCGATTACCTGGGTTGGTGCGTTA-3r ； P2, 5r -CTGTCAAACATGAGAATTACGTGTCATAGCAATACT-3r ； P2引物中Y端的CTGTCAAACATGAGAATT部分序列属于与片段B(四环素抗性基因表达 序列）接头处的重叠区域； 50 μ L扩增体系设计如下： 枯草芽孢杆菌基因组DNA，1 μ L ; 2Xpfu Mix? 25 μ L ； Pl 引物，I yL ; Ρ2 引物，I yL ; ddH20, 22 μ L ； PCR扩增：94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30 s，72°C延伸I min，共30个循 环，72°C延伸10min，扩增产物经电泳并提取回收备用； C. 片段B (四环素抗性基因表达序列）的PCR扩增，以质粒pBR322为模板，根据质粒 的序列设计引物如下： P3, 5r -AGTATTGCTATGACACGTAATTCTCATGTTTGACAG-3r ； P4，5' -TATCAAACACTAATCCAAGTCACCCGAGATGCGCC-3'; P3引物中Y端的AGTATTGCTATGACACGT部分序列属于与片段A (i/上游部分序列） 接头处重叠区域； P4引物中Y端的TATCAAACACTAATCCAA部分序列属于与片段C UA/基因下游部分序 列）接头处重叠区域； 50 μ L扩增体系设计如下： 质粒 pBR322，l yL ; 2Xpfu Mix? 25 μ L ； Ρ3 引物，I yL ; Ρ4 引物，I yL ; ddH20, 22 μ L ； ?〇?扩增：94°(：预变性51^11，94°(：变性308,60°(：退火30 8,72°(：延伸90 8，共30个循 环，72°C延伸lOmin，扩增产物经电泳并提取回收备用； D. 片段C( 基因下游部分序列)的PCR扩增，以步骤A所提取的枯草芽孢杆菌WB800 基因组的总DNA为模板，根据枯草芽孢杆菌基因组序列（GenBank序列号CP010052. 1)设计 如下引物： Ρ5，5' -GGCGCATCTCGGGTGACTTGGATTAGTGTTTGATA-3'; P6,5， -TCCGGACCCGGGCCATAAAAGTAATAGAAACACAGTAAAG -3，； Ρ5引物中Y端的GGCGCATCTCGGGTG部分序列属于与片段B (四环素抗性基因表达序 列）接头处的重叠区域； 50 μ L扩增体系设计如下： 枯草芽孢杆菌基因组DNA，1 μ L ; 2Xpfu Mix? 25 μ L ； Ρ5 引物，I yL ; Ρ6 引物，I yL ; ddH20, 22 μ L ； PCR扩增：94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30 s，72°C延伸I min，共30个循 环，72°C延伸lOmin，扩增产物经电泳并提取回收备用； E. PCR融合，将步骤B、步骤C、步骤D所制备的PCR扩展产物进行PCR融合，融合PCR 进行三轮，具体过程如下： 第一轮融合PCR，以片段A、片段B为模板，不添加引物进行PCR扩增； 49 μ L扩增体系设计如下： 2Xpfu Mix? 25 μ L ； 上游基因片段A的PCR纯化产物，1 μ L ; 抗性基因片段B的PCR纯化产物，1 μ L ; ddH20, 22 μ L ； 扩增条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30 s，72°C延伸150 s，共14个 循环，72°C延伸lOmin，扩增产物4°C保存备用； 第二轮融合PCR，在第一轮PCR反应液中添加片段C进行扩增； 50 μ L扩增体系设计如下： 第一轮PCR反应溶液，49 μ L ; 下游基因片段C的PCR纯化产物，1 μ L ; 扩增条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30 s，72°C延伸210s，共14个 循环，72°C延伸lOmin，扩增产物4°C保存备用； 第三轮融合PCR，在第二轮PCR反应液中添加引物Pl和引物P6 ; 100 μ L扩增体系设计如下： 第二轮PCR反应溶液，50 yL; 2 X LA Taq Mix，46 μ L ; 引物 Pl，2 yL; 引物 P6,2 yL; 扩增条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30 s，72°C延伸150s，共14个 循环，72°C延伸lOmin，扩增产物经电泳并提取回收备用。
[0018] 经过三轮融合后的PCR扩增产物即为人工构建的不含(敲除）产孢致死因子基因 (if)的基因序列。
[0019] 对片段A、片段B、片段C扩增后产物电泳图如图1所示。
[0020] 三轮融合后PCR产物的电泳检测结果如图2所示。
[0021] (2)电击转化 将步骤（1)中所构建不含(敲除）产孢致死因子基因（?々/)的基因序列电击转化枯草芽 孢杆菌感受态细胞，获得转化子，具体过程如下： 取6〇μL枯草芽孢杆菌WB800感受态细胞，加入WL (50ng/^L)的纯化后不含盐离子的 步骤（1)所制备的不含(敲除基因的DNA片段，混匀；转移到Imm预冷的电击转化杯中， 冰浴5min，然后进行电击，电击条件是电压2kv、200 Ω，电击时间5. 5~5ms ; 电击后立即加入ImL预冷的电击恢复液RM，37°C孵育(摇床低速培养）3h，然后涂布于 含有20 mg/mL四环素的LB平板上，37 °C倒置并过夜培养。
[0022] 次日观察转化子形态和个数，形成单一的白色菌落后取出置于4°C冰箱保存。
[0023] 白色菌落(转化子）即所构建新的枯草芽孢杆菌菌株。
[0024] (3)筛选验证 对所构建的枯草芽孢杆菌菌株，一般而言，尚需进一步筛选验证，才能证明其构建成 功，并具体应用。筛选验证主要是指以转化子和出发菌株(枯草芽孢杆菌WB800)的基因组 为模板，分别对跨基因组DNA与同源重组片段的PCR验证、跨基因组DNA与同源重组片段上 游序列的PCR验证、跨基因组DNA与同源重组片段下游序列的PCR验证，具体过程简要介绍 如下。
[0025] 跨基因组DNA与同源重组片段的PCR验证 任选能够在四环素抗性平板上生长的7个单一的白色菌落，置于5mL的含有20 mg/mL 的四环素抗性的液体LB培养基中，37°C、220 rpm/min摇床震荡培养12~16h，选取浑浊的试 管，提取细菌基因组DNA进行PCR验证。
[0026] 设计引物序列如下： Yl-F^r -ACCGTGTATGAAATCTAACAATGC-3r ； Y2-R,5r -GCCGCAAACGGAGCAACTATT-3r ； 50 μ L扩增体系设计如下： pfu 酶，22 μ L ; 细菌基因组DNA，1 yL ; 引物 Yl-F，l yL ; 引物 Y2-R，l yL ; ddH20, 25 μ L ; PCR扩增：94°C预变性5min，94°C变性30s，51°C退火30 s，72°C延伸2 min，共30个循 环，72 °C延伸IOmin，扩增产物进行凝胶电泳检测。
[0027] PCR产物电泳检测结果如图3所示。
[0028] 从图中可以看出，只有4号和5号转化子在4000