bp左右的位置扩增出条带，此位 置正是产孢致死因子基因被敲除后的片段长度。而出发菌株和其余的转化子只在7000多 bp的位置扩增出条带，该位置是整合前的完整基因序列。从而验证结果可以大致判断融合 片段是否整合到菌株染色体中的正确位置。另外，由于4号和5号转化子(菌株）也能扩增 出7000多bp的条带，推测可能是转化菌株不纯，因而尚需进一步进行二次抗性筛选以得到 纯合的转化子菌株。
[0029] 跨基因组DNA与同源重组片段上游序列的PCR验证 基于上述PCR验证结果，为进一步验证5号转化子菌株是否确实是产孢致死因子基因 敲除的阳性菌株，因此进一步进行跨基因组DNA与同源重组片段上游序列的PCR验 证。
[0030] 首先设计引物序列如下： Yl-F^r -ACCGTGTATGAAATCTAACAATGC-3r ； Yl-R，5， -GCGGGACCAGTGACGAAG-3'; 50 μ L扩增体系设计如下： pfu 酶，22 μ L ; 细菌基因组DNA，1 yL ; 引物 Yl-F，l yL ; 引物 Yl-R，l yL ; ddH20, 25 μ L ; PCR扩增：94°C预变性5min，94°C变性30s，51°C退火30 s，72°C延伸2 min，共30个循 环，72 °C延伸IOmin，扩增产物进行凝胶电泳检测。
[0031] 电泳结果见图4。
[0032] 从图中可以看出，5号转化子在正确的位置扩增出单一条带，而出发菌株则无法扩 增出正确条带。
[0033] 跨基因组DNA与同源重组片段下游序列的PCR验证 基于上述PCR验证结果，对5号转化子菌株进一步进行了跨基因组DNA与同源重组片 段下游序列的PCR验证。
[0034] 首先设计引物序列如下： Y2-F，5' -TGTCGCTTGCGGTATTCGGA-3'; Y2-R,5r -GCCGCAAACGGAGCAACTATT-3r ； 50 μ L扩增体系设计如下： pfu 酶，22 μ L ; 细菌基因组DNA，1 yL ; 引物 Y2-F，l yL ; 引物 Y2-R，l yL ; ddH20, 25 μ L ; PCR扩增：94°C预变性5min，94°C变性30s，51°C退火30 s，72°C延伸2 min，共30个循 环，72 °C延伸IOmin，扩增产物进行凝胶电泳检测。
[0035] 电泳结果如图4所示。
[0036] 从图中可以看出，5号转化子在正确的位置扩增出单一条带，而出发菌株则无法扩 增出正确条带。
[0037] 实施例2 本实施例主要是对实施例1所构建的新的枯草芽孢杆菌菌株(即5号转化子菌株)进行 应用性检验，主要包括活菌数和发酵后淀粉酶活力测定两项内容，相关检验情况介绍如下。
[0038] 活菌数测定 对实施例1所获得的5号转化子(所构建的新的枯草芽孢杆菌菌株）和出发菌株(枯草 芽孢杆菌WB800)分别进行摇瓶培养，37°C、220rpm，分别取培养24h后菌液0. lmL，分别加入 含有0. 9mL无菌水的离心管中，涡旋混匀，并分别进行10倍系列稀释（10、101、102、10 3、104、 105、106、107、108、109) 〇
[0039] 吸取0.1 mL稀释液，加入LB固体平板中，然后用涂布棒将菌液涂布均匀，每个稀释 度做3个平皿，静置30min后倒置于37°C恒温培养箱中，16~20h后取出平板，计算平板内 菌落数，再乘以稀释倍数，即得每毫升菌液样品中所含枯草芽孢杆菌细胞数(菌落形成单位 cfu)〇
[0040] 具体统计结果如图5所示。
[0041] 统计结果表明，5号转化子的活菌数为I. 72X IO9 cfu/mL，而出发菌株的活菌数为 8. 24X108 cfu/mL，即：5号转化子的活菌数显著高于出发菌株，比出发菌株提高108. 67%(p < 0. 05)〇
[0042] 发酵淀粉酶活力测定 对实施例1所获得的转化子(所构建的新的枯草芽孢杆菌菌株）和出发菌株(枯草芽孢 杆菌WB800)分别在LB液体培养基中37°C、220rpm/min摇床培养，取菌液，4°C、8000rpm离 心20min，取其上清液即为含有发酵淀粉酶的粗酶液。
[0043] 对粗酶液采用DNS法测定其淀粉酶活力，具体测定步骤如下： (1) 取20支20mL的具塞刻度试管，预先灭菌干燥，并标号；对出发菌株(枯草芽孢杆菌 WB800)和转化子(所构建的新的枯草芽孢杆菌菌株）分别于16h和24h分别取样，取样量均 为lmL，离心、获得粗酶液，同时设置对照组，对照组中粗酶液煮沸20分钟灭活； (2) 向步骤（1)中粗酶液或灭活后粗酶液中分别加入2%可溶性淀粉溶液lmL，蒸馏水 3mL，60°C保温 5min ; (3) 向步骤（2)溶液中加入浓度为0. lmol/L的柠檬酸缓冲液（PH6. 5) lmL，60°C水浴中 保温30min ; (4) 向步骤（3)溶液中加入I. 5mL DNS试剂，沸水浴5min，然后迅速冷却，加蒸馏水定 容至20mL ; (5) 将步骤（4)溶液摇匀，分光光度计测定520nm处的OD值，并查阅麦芽糖溶液的吸光 值标准曲线得到对应的麦芽糖含量。
[0044] 在本发明中，酶活力单位定义为：在60°C、pH 6. 5的条件下，30min释放Img麦芽 糖所需的酶量为一个酶活力单位。
[0045] 检测结果如图6所示。
[0046] 从图中可以看出，5号转化子菌株在培养16h和24h的酶活力分别是27. 07 U/mL 和26. 11 U/mL，而出发菌株的酶活仅为16. 17 U/mL和19. 33 U/mL，此结果表明，5号转化子 酶活比出发菌株分别提高67. 42%和34. 48% (/?< 0. 05)。
【主权项】
1. 一种改造枯草芽孢杆菌菌株的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： (1)人工构建不含产孢致死因子基因的基因序列， 所述不含产孢致死因子基因的基因序列，由3部分DNA片段组成，分别是基因上游 部分序列片段ASEQIDNO. 1、四环素抗性基因表达序列片段BSEQIDNO. 3、基因下 游部分序列片段CSEQIDNO. 2 ; (2)电击转化， 将步骤（1)中所构建不含(敲除）产孢致死因子基因（sAf)的基因序列电击转化枯草芽 孢杆菌感受态细胞，获得转化子； (3)筛选验证， 对步骤（2)所构建的枯草芽孢杆菌菌株，筛选、验证获得不含产孢致死因子基因正确转 化菌株。2. 如权利要求1所述改造枯草芽孢杆菌菌株的方法，其特征在于，步骤（1)中所述人工 构建不含产孢致死因子基因的基因序列的具体过程如下： A提取枯草芽孢杆菌基因组的总DNA备用； B以步骤A所提取的枯草芽孢杆菌基因组的总DNA为模板，设计引物，PCR扩增，扩增 产物经电泳并提取回收备用； C以质粒pBR322为模板，设计引物，PCR扩增，扩增产物经电泳并提取回收备用； D以步骤A所提取的枯草芽孢杆菌基因组的总DNA为模板，设计引物，PCR扩增，扩增产 物经电泳并提取回收备用； E将步骤B、步骤C、步骤D所制备的PCR扩展产物进行三轮PCR融合，经过三轮融合后 的PCR扩增产物即为人工构建的不含产孢致死因子基因的基因序列。3. 如权利要求1所述改造枯草芽孢杆菌菌株的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌 菌株为枯草芽孢杆菌WB800。4. 利用权利要求2所述改造枯草芽孢杆菌菌株方法所构建的枯草芽孢杆菌菌株，用于 淀粉酶的制备。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种改造枯草芽孢杆菌菌株的方法。该方法包括人工构建不含产孢致死因子基因的基因序列、电击转化、筛选验证等步骤。现有技术中，对于产孢致死因子基因（<i>skf</i>）虽然已有部分基础研究，但通过敲除产孢致死因子基因是否可以提高内源酶产量则是未知数，同时对于不同微生物菌株，敲除产孢致死因子基因后对于菌株发酵能力的改进是否相同更是缺乏研究。本发明以具体的枯草芽孢杆菌菌株为例，成功构建了缺失产孢致死因子基因（<i>skf</i>）的新菌株，在将该菌株具体用于发酵生产淀粉酶时，测定结果表明，所构建的新菌株的酶活得到了较好提升，显现出了较好地应用前景。
【IPC分类】C12N9/26, C12N1/21, C12R1/125, C12N15/87
【公开号】CN105177049
【申请号】
【发明人】焦国宝, 邱立友, 田芳, 王明道, 孙利鹏, 宋安东
【申请人】河南仰韶生化工程有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月24日