AdTrack-CMV腺病毒穿梭载体（命名 为pAdTrack-CMV-SPO)，同时分别构建携带突变体SPmO, SmPO,和SmPmO的pAdTrack-CMV质 粒。电泳重组质粒的双酶切产物，结果显示，各穿梭质粒酶切出的片段大小与预期一致（图 3) 图中八：3?0,3?111〇,31^0，和31^111〇。8 421。进一步测序证实所有序列与预期完全一致。
[0020] 将携带目的基因的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasyl同 源重组，重组质粒经Pac I酶切，阳性质粒可酶切出4. 5kb或3kb的条带（图4)。
[0021] 将重组腺病毒质粒转染AD-293细胞，包装获得原代腺病毒，原代病毒经4轮扩增 获得第5代病毒。将第5代病毒感染32DP T315I白血病细胞，westernblot检测到各目的 蛋白的表达，蛋白分子量大小与预测值相符，其中SPO, SPmO, SmPO和SmPmO为98KD，AZl为 27KD (图5)，证实制备的重组腺病毒可在CML细胞中表达出目的蛋白。
[0022] 2. SPOA系统靶向CML耐药细胞中BCR-ABL Y177去磷酸化，对正常c-ABL活化没有 影响
[0023] 接下来，我们检测了 SPOA系统对BCR-ABL的去磷酸化效应。为了避免蛋白降解 效应对去磷酸化效应观察的干扰（因为蛋白降解和去磷酸化都会导致BCR-ABL磷酸化的 减少），我们在检测去磷酸化效应时只表达SP0,不表达AZ1。实验选取的32DP T315I细胞 (BCR-ABL T315I转化的32D细胞）对所有一代和二代TKI耐药。结果所示，SPO可以有效去 除32DP T315I细胞中BCR-ABL Y177的磷酸化，而伊马替尼不能抑制该耐药细胞中BCR-ABL Y177的磷酸化。SPmO,无磷酸酶活性的突变体，对BCR-ABL Y177磷酸化没有影响。同时， 我们也检测了 SPO对BCR-ABL以及正常c-ABL激酶活性的影响，结果显示，SPO对BCR-ABL 激酶活性和正常c-ABL激酶活性均无明显抑制作用（图6)。以上结果表明，SPO可以靶向 CML耐药细胞中BCR-ABL Y177去磷酸化，对正常c-ABL活化没有影响。
[0024] 3. SPOA系统促进CML耐药细胞中BCR-ABL蛋白降解，对正常c-ABL表达没有影响
[0025] SPO和AZl腺病毒共感染32DP T315I细胞，western blot检测BCR-ABL表达，结果 显示，SPOA明显降低了 BCR-ABL的表达，同时对正常c-ABL激酶的表达没有影响。而SmPOA 突变体，由于不能结合BCR-ABL，对BCR-ABL的表达没有影响（图7)。
[0026] 4. SPOA系统抑制CML耐药细胞增殖
[0027] SPOA通过去磷酸化BCR-ABL Y177抑制了 BCR-ABL活性，通过降解BCR-ABL减少 了其蛋白的表达，理论上将抑制BCR-ABL的恶性转化潜能。我们通过MTT实验检测SPOA对 32DP T315I细胞增殖的影响，结果发现，SPOA可以显著抑制32DP T315I的增殖，而SmPmOA 突变对照组对CML细胞的生长与null组没有显著差异（图8)。以上结果证实SPOA系统可 抑制CML耐药细胞的增殖。
[0028] 5. SPOA系统促进CML耐药细胞凋亡
[0029] 我们通过流式细胞术分析SPOA对32DP T315I细胞凋亡的影响，结果显示SPOA可 显著增加32DP T3151细胞的凋亡率（p〈0. 05)，证实SPOA系统可促进CML耐药细胞的凋亡。 如图9所示，A :代表性的流式细胞术检测结果。B :凋亡检测结果的统计分析。
[0030] 有益效果：
[0031] 通过实验验证本发明的系统和方法可以杀灭白血病耐药细胞，并且效果非常好， 对于治疗白血病的研究及药物的开发具有很大的研究价值。
【附图说明】
[0032] 图1为杀灭慢性粒细胞白血病耐药细胞的系统及方法示意图；
[0033] 图2基因扩增产物的电泳图；
[0034] 图3重组pAdTrack-CMV质粒双酶切产物电泳图；
[0035] 图4重组腺病毒质粒的酶切产物电泳图；
[0036] 图5 Western blot检测目的蛋白在CML细胞中的表达图；
[0037] 图6 Western blot检测SPOA系统对BCR-ABL Y177的靶向去磷酸化效应图；
[0038] 图7 Western blot检测SPOA系统对BCR-ABL的靶向降解效应图；
[0039] 图8 MTT实验检测SPOA系统对32DP T315I细胞的增殖抑制效应图；
[0040] 图9流式细胞术检测SPOA系统对32DP T315I细胞的促凋亡效应图。
【具体实施方式】
[0041] 如图1所示，一种杀灭慢性粒细胞白血病耐药细胞的系统，由载入腺病毒的 SH2-PTP1B/C-0DC融合基因和AZl基因组成；所述SH2-PTP1B/C-0DC融合基因和AZl基因 载入的腺病毒为Ad5腺病毒。
[0042] 所述SH2-PTP1B/C-0DC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；
[0043] 所述AZl基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0044] -种杀灭慢性粒细胞白血病耐药细胞的方法，分别制备装SH2-PTP1B/C-0DC融合 基因和AZl基因的Ad5重组腺病毒；感染CML细胞，在CML细胞中表达SH2-PTP1B/C-0DC 融合蛋白和AZl蛋白；PTP1B/C借SH2与BCR-ABL Y177的结合，将Y177去磷酸化，抑制 BCR-ABL活性；同时，借SH2信号将BCR-ABL打上ODC标签，在共表达AZ1的情况下，将 BCR-ABL引入0DC-AZ1非泛素化-蛋白酶体降解途径，在抑制癌蛋白活性的同时，也促进了 癌蛋白的降解，从而杀灭CML耐药细胞。
【主权项】
1. 一种杀灭慢性粒细胞白血病耐药细胞的系统，其特征在于：由载入腺病毒的 SH2-PTP1B/C-0DC融合基因和AZl基因组成； 所述SH2-PTP1B/C-0DC融合基因的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示； 所述AZl基因的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。2. 根据权利要求1所述杀灭慢性粒细胞白血病耐药细胞的系统，其特征在于：所述 SH2-PTP1B/C-0DC融合基因和AZl基因载入的腺病毒为Ad5腺病毒。3. -种杀灭慢性粒细胞白血病耐药细胞的方法，其特征在于：分别制备装载 SH2-PTP1B/C-0DC融合基因和AZl基因的Ad5重组腺病毒；感染CML细胞，在CML细胞中 表达SH2-PTP1B/C-0DC融合蛋白和AZl蛋白；PTP1B/C借SH2与BCR-ABLY177的结合，将 Y177去磷酸化，抑制BCR-ABL活性；同时，借SH2信号将BCR-ABL打上ODC标签，在共表达 AZl的情况下，将BCR-ABL引入ODC-AZl非泛素化-蛋白酶体降解途径，在抑制癌蛋白活性 的同时，也促进了癌蛋白的降解，从而杀灭CML耐药细胞。
【专利摘要】本发明一种杀灭慢性粒细胞白血病耐药细胞的系统，由载入腺病毒的SH2-PTP1B/C-ODC融合基因和AZ1基因组成。通过实验验证本发明的系统和方法可以杀灭白血病耐药细胞，并且效果非常好，对于治疗白血病的研究及药物的开发具有很大的研究价值。
【IPC分类】C12N5/10, C12N15/861
【公开号】CN105177046
【申请号】
【发明人】冯文莉, 高淼, 黄峥兰, 徐敏
【申请人】重庆医科大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月14日