一种杀灭慢性粒细胞白血病耐药细胞的系统及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学基础研究领域，具体的说，涉及一种杀灭白血病耐药细胞的系统 和方法。
【背景技术】
[0002] 慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia, CML)是血液系统的常见恶性肿 瘤，如果治疗不当，患者在5年内由慢性期进展至不可逆转的急变期而丧失生命。CML主要 发病机制是由于9号染色体的c-abl基因与22号染色的bcr基因发生t (9, 22) (q34, qll) 平衡易位，形成bcr-abl融合基因，编码具有高酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，该融 合蛋白激活下游RAS-MAPK，PI3K-AKT，STAT5, CRKL等多条信号通路，导致细胞增殖失控和 凋亡受阻。临床上的一线治疗药物伊马替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI)，通过竞争性抑制ATP与BCR-ABL激酶的结合，使BCR-ABL不能磷酸化下 游底物，从而发挥疗效。伊马替尼可以使大约70%慢性期患者获得血液学或遗传学的完全 缓解，但是BCR-ABL激酶区的突变，使伊马替尼与BCR-ABL的结合受阻，导致另外30%的患 者对伊马替尼耐药。尤其是携带BCR-ABL Τ315Ι突变的患者，对所有第二代TKI仍然耐药。 尽管专门针对BCR-ABL Τ315Ι的第三代TKI已经问世，但是毒副作用太大的问题限制了其 临床使用，因此，仍需寻找新的治疗策略以克服临床耐药问题。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种杀灭 白血病耐药细胞的系统和方法。
[0004] 本发明目的是这样实现的：
[0005] 通过SPOA系统靶向BCR-ABL Υ177去磷酸化和降解杀灭CML耐药细胞的立项依据 如下：
[0006] 1.多个功能域参与BCR-ABL致病，提示可寻求ABL外的其他抑制位点：
[0007] BCR-ABL蛋白由BCR与ABL融合而成，除ABL外，BCR的多个功能域在BCR-ABL的 致病中也发挥着重要作用。既然ABL激酶区由于突变导致耐药，因此，可寻找ABL突变活跃 区以外的抑制靶点。位于BCR结构域的第177位酪氨酸（Υ177)在CML的致病中同样发挥 着重要的作用。当Υ177自磷酸化后，特异性募集接头蛋白GRB2(Growth factor receptor bound protein 2)，磷酸化的Y177与GRB2的SH2(src homology 2)结构域结合后，再通 过GRB2N端及C端的SH3 (src homology 3)结构域分别结合下游的S0S、GAB2分子，分别 激活下游RAS-MPK和PI3K-AKT信号通路，导致细胞恶性转化。Y177磷酸化缺陷的突变体 Y177F不能转化Rat-I成纤维细胞，致小鼠发病能力也显著下降。可见，Y177的磷酸化对于 BCR-ABL激活下游信号通路而致病非常重要。因此，Y177可作为ABL外的抑制靶点。
[0008] 2. BCR-ABL的过度磷酸化导致下游多条信号通路异常活化，提示可通过磷酸酶将 BCR-ABL去磷酸化：
[0009] 在调节细胞的功能中，磷酸化是重要的步骤。细胞内蛋白质的磷酸化水平由蛋白 酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases, PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases, PTPs)的相互协调及竞争作用而控制。BCR-ABL等PTKs使底物磷酸化，而 PTPs使底物去磷酸化。BCR-ABL异常升高的磷酸化信号，使其下游RAS-MAPK，PI3K-AKT， STAT5, CRKL等多条信号通路持续活化，导致细胞增殖失控和凋亡受阻，促进CML的发生及 进展。PTPlB是PTP家族成员，已知对多种酪氨酸激酶发挥去磷酸化作用。这提示我们，可 以利用PTPlB的去磷酸化功能将BCR-ABL去磷酸化。
[0010] 3. BCR-ABL蛋白的表达是导致CML发病的根本原因，提示降解BCR-ABL可消除CML 的致病根源：
[0011] BCR-ABL激酶区突变导致伊马替尼与BCR-ABL的结合受阻，从而导致伊马替尼对 BCR-ABL活性的抑制能力下降。归根结底，BCR-ABL激酶活性的发挥必须以BCR-ABL蛋白 表达为前提，因此，促进BCR-ABL降解可发挥斩草除根的作用，自然可以发挥杀灭BCR-ABL 突变体细胞的作用。包括BCR-ABL在内的绝大多数蛋白通过经典的泛素化-蛋白酶体途径 降解，该途径由于过程复杂，可操作性差。同时，BCR-ABL蛋白在CML细胞中是过表达的，这 提示BCR-ABL本身的泛素化降解途径是受抑的，必须利用其它的降解途径人为的促进其降 解。鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase, 0DC)是经典的不需要泛素化而直接降解的 蛋白，它与其辅因子抗酶蛋白l(Antizymel，AZl)结合后直接经蛋白酶体降解。国外学者将 ODC与乳头瘤病毒E7蛋白的Rb结合结构域融合，利用E7与Rb的结合将Rb打上ODC标签， 成功引导Rb蛋白经0DC-AZ1途径降解。这提示我们，将BCR-ABL打上ODC标签，就能引导 BCR-ABL经0DC-AZ1途径降解。
[0012] 基于以上分析，我们设计了一个BCR-ABL的"捕获-失活-降解"系统。该系统由 3部分组成：
[0013] I. BCR-ABL的捕获装置：我们的前期研究证实，GRB2的SH2结构域可以高效结合 BCR-ABL Y177位点，该位点保守，未见发生突变的报道，可发挥捕获BCR-ABL的作用。
[0014] 2. BCR-ABL的失活装置：该部分为发挥去磷酸化功能的PTP1B。PTPlB对底物的去 磷酸化作用必须依赖于与底物的直接结合。为了避免PTPlB结合其他底物，发生非特异的 去磷酸化反应，我们只表达了 PTPlB的催化结构域（PTP1B/C)。这样，PTP1B/C只有通过SH2 结合BCR-ABL，才能发挥其去磷酸化功能，而不影响细胞内其他蛋白的磷酸化。PTP1B/C将 BCR-ABL Y177去磷酸化，从而抑制BCR-ABL的活性。
[0015] 3. BCR-ABL的降解装置：我们在SH2-PTP1B/C的C端融合表达0DC，借SH2与 BCR-ABL的结合将BCR-ABL打上ODC标签，在共表达AZl的情况下，引导BCR-ABL经0DC-AZ1 途径降解。
[0016] 综合以上分析，我们提出以下研究思路：分别制备装载SH2-PTP1B/C-0DC融合基 因和AZl基因的Ad5重组腺病毒（简称SPOA系统，图1)，感染CML细胞，在CML细胞中表达 SH2-PTP1B/C-0DC 融合蛋白和 AZl 蛋白。PTP1B/C 借 SH2 与 BCR-ABL Y177 的结合，将 Y177 去磷酸化，抑制BCR-ABL活性。同时，借SH2信号将BCR-ABL打上ODC标签，在共表达AZl 的情况下，将BCR-ABL引入0DC-AZ1非泛素化-蛋白酶体降解途径，在抑制癌蛋白活性的同 时，也促进了癌蛋白的降解，从而杀灭CML耐药细胞。
[0017] 实验结果
[0018] 1.成功制备装载SPOA系统的Ad5重组腺病毒
[0019] 以K562细胞cDNA为模板，扩增目的基因 SH2, PTP1B/C，0DC，和AZ1。同时构建用 于后续对照的SH2R27K突变体（不能结合Y177,以下简称Sm)和PTPlB/⑶181A突变体（无 催化活性，简称Pm)。琼脂糖凝胶电泳PCR产物，结果显示的电泳条带大小与预期一致（图 2) 图中A:SH2和Sm。B:PTP1B/C。C:0DC。D:重叠 PCR技术扩增的Pm。E:重叠 PCR技术扩 增的AZ1。将SH2, PTP1B/C，和ODC基因依次连接入p